SiO2-Pickering乳液佐剂增强沙眼衣原体Pgp3蛋白免疫效果

史可靓, 方春霞, 赵兰华, 周辉, 李忠玉

1.南华大学衡阳医学院病原生物学研究所 特殊病原体防控湖南省重点实验室,湖南衡阳 421001;2.湖南中医药大学第一附属医院,湖南长沙 410007

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一类在细胞内寄生的微生物,感染不同人体部位可诱发不同疾病,长期反复使用抗生素治疗易产生耐药性[1-2],因此,衣原体疫苗可能是有效预防衣原体感染的关键,但由于衣原体血清型和抗原构象复杂,目前还没有临床应用疫苗的报道。

Pgp3是由Ct质粒编码的唯一能分泌到宿主细胞胞质的蛋白[3],是Ct调控宿主细胞通路维持生存的关键毒力因子。Pgp3能诱导机体产生高效价抗体,具有良好免疫原性[4],但单独的Pgp3蛋白疫苗不足以产生高效的免疫应答和免疫保护以快速清除Ct感染[5],因此寻找安全、有效的佐剂来增强其免疫效果尤为重要。Pickering乳液是采用固体粒子稳定油水体系的一种新型乳液,不易受pH值、温度、盐含量及油相组成的影响,具有良好稳定性[6]。二氧化硅(SiO2)因颗粒直径可控、安全、稳定等诸多优势而成为最常用于制备Pickering乳液的固体粒子。Pickering乳液能通过控制对抗原蛋白的装载与吸附来有效增强免疫效果[7]。本研究通过优化构建安全稳定的SiO2Pickering(SPE)乳液佐剂,将SPE乳液佐剂联合Ct Pgp3蛋白免疫BABL/c小鼠,探讨SPE乳液佐剂对Pgp3蛋白的免疫增强作用及其机制,为Ct感染性疾病的预防与治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料

BABL/c雌性小鼠(4周龄,SPF级)购于斯莱克景达实验动物有限公司;BCA蛋白测定试剂盒购于康为世纪公司;ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)均购于Biolegend公司;CCK-8试剂盒购于DOJINDO Molecular公司;pGEX-6p-1/Pgp3重组质粒转化菌E.coli XL1-blue为本课题组保存。

1.2 SPE乳液制备和表征分析

为了制备出稳定、液滴直径小而均一的Pickering乳液,本实验从水油比、SiO2质量浓度、超声功率这几方面进行优化。将SiO2纳米颗粒与去离子水混合,搅拌至粉末完全溶解,配置不同质量浓度(1、5、10 g/L)SiO2水相。吸取适量SiO2水相与液体石蜡(liquid paraffin,LP)混合,不同水油体积比分别为10∶1、10∶2、10∶4。设置不同功率(67～670 W)超声制备SPE乳液佐剂。SPE乳液静置8～12 h后,光学普通显微镜下观察乳液微观结构,Nanomeasure软件分析液滴平均粒径;SPE乳液用去离子水稀释100倍后,取1.5 mL加入到激光粒度分析仪样品池中,测定乳液颗粒平均粒径以及聚合物分散性指数(polymer dispersibility index,PDI)。

1.3 Pgp3蛋白表达纯化及鉴定

将pGEX-6p/Pgp3转化菌株接种于LB固体培养基(Amp抗性),37 ℃培养过夜,挑取单个菌落加入液体培养基37 ℃、220 r/min培养12 h,取适量菌液加入600 mL液体培养基(Amp抗性)37 ℃、220 r/min扩大培养4 h,随后加入IPTG(终浓度0.2 mmol/L)于37 ℃、180 r/min诱导培养6 h,离心超声裂解菌液后收集上清,树脂纯化后加入PreScission Protease切除GST标签,离心收集上清Pgp3蛋白。使用BCA法测定蛋白水平,并使用SDS-PAGE凝胶电泳及Western blotting分析鉴定。

1.4 BALB/c小鼠免疫接种

选取4周龄BABL/c雌性小鼠30只,随机均分成SPE+Pgp3组、Pgp3组和PBS组。SPE+Pgp3组采用SPE乳液佐剂与50 μg Pgp3蛋白混合后免疫;Pgp3组采用50 μg Pgp3蛋白单独免疫;PBS组则注射50 μg PBS作为对照。3组均采取皮下注射方式,于0、2、4周分别进行3次免疫。

1.5 抗原特异性抗体的检测

分别于0、2、4、6周小鼠尾静脉采血,4 ℃静置过夜,5 000 r/min离心10 min,收集血清-20 ℃储存备用。用0.05 mmol/L碳酸盐缓冲液稀释Pgp3蛋白至100 mg/L,在96孔ELISA板中每孔加入100 μL,4 ℃包被过夜;使用PBST洗涤后每孔加入250 μL含5%脱脂奶粉的封闭液,37 ℃封闭2 h;洗涤封闭液后每孔加入100 μL倍比稀释的小鼠血清进行一抗孵育,同时设置阴性对照组和空白组,37 ℃孵育2 h;洗涤5次后每孔加入100 μL按比例稀释HRP标记羊抗鼠IgG(1∶5 000)、IgG1(1∶5 000)、IgG2a(1∶5 000),37 ℃孵育1 h;孵育洗涤完成后加入TMB显色液避光显色15 min,加入2 mmol/L H2SO4(50 μL/孔)终止反应。使用酶标仪检测各孔波长450 nm处光密度值(optical density,OD),比较IgG及其亚类IgG1、IgG2a抗体滴度。

1.6 淋巴细胞增殖的检测

收集小鼠6周时脾淋巴细胞,加入2×106个/mL 200 μL脾淋巴细胞悬液至96孔培养板,每孔加入10 μg Pgp3蛋白刺激淋巴细胞,同时设置刺激组和未刺激组,37 ℃、5%CO2培养48 h,每孔加入10 μL CCK-8试剂继续培养4 h,使用酶标仪检测450 nm处OD值,并计算刺激指数(stimulation index,SI),SI=(OD刺激组-OD空白组)/(OD未刺激组-OD空白组)。

1.7 细胞因子的检测

收集6周小鼠脾淋巴细胞,加入1 mL 2×106个/mL脾淋巴细胞悬液至24孔培养板,每孔加入10 μg Pgp3蛋白刺激淋巴细胞,充分混匀,37 ℃、5%CO2培养48 h,刺激完成后,收集培养液上清液,根据试剂盒说明书检测脾淋巴细胞上清IFN-γ、IL-4水平。

将6周时的脾淋巴细胞接种至24孔培养板,每孔加入1 μL刺激剂,刺激5 h后收集细胞,800 g离心5 min后弃去上清,加入0.5 μL Fc阻断剂孵育10 min后,加入表面染色抗体(CD4-FITC、CD8-Percp Cy5.5)冰上孵育40 min;每个样本中加入100 μL IC Fixation Buffer于冰上固定40 min;再加入800 μL破膜液,800 g离心7 min,重复破膜1次,弃上清后按说明书加入胞内抗体(IFN-γ-APC、IL-4-PE),避光孵育60 min,加入300 μL PBS重悬进行流式细胞术检测脾淋巴细胞上清IFN-γ、IL-4水平。

1.8 统计学分析

采用Graphpad Prism 9软件进行数据处理和分析,组间比较采用Student’st检验和单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SPE乳液的优化与表征

SiO2颗粒能稳定LP油相,外观呈细腻流体状;光学显微镜下SiO2乳液粒径小而均一,且10∶2水油比时颗粒更为均匀。随超声功率增加,乳液粒径逐渐减小且均一,当超声功率达675 W时,粒径反而增大且不均匀。随SiO2质量浓度1、5、10 g/L的增大,形成的乳液粒径增大且均匀性降低。根据以上结果,选择SPE最优制备条件为超声功率337 W、水油比10∶2、SiO2质量浓度1 g/L,最优条件下SPE粒径为(300.12±44.26) nm,PDI为0.33±0.12(图1)。

图1 SPE乳液的优化与表征

2.2 Pgp3蛋白鉴定结果

如图2A所示,26 kD处出现与Pgp3蛋白分子量相符合的条带;Western blotting验证,26 kD处出现明显条带(图2B)。

图2 Pgp3蛋白的纯化和鉴定A为SDS-PAGE鉴定;B为Western blotting鉴定。M为Marker;1和3为GST-Pgp3融合蛋白剪切纯化后产物;2为对照。

2.3 各组抗原特异性抗体的比较

PBS组未检测出特异性抗体,其他各组均随免疫次数的增多,小鼠血清抗体滴度逐渐升高;6周时,SPE+Pgp3组IgG总抗体、亚类IgG1、IgG2a的滴度高于Pgp3组(P<0.05;图3),SPE+Pgp3组、Pgp3组IgG2a/IgG1分别为1.22和1.15,其中SPE+Pgp3组的IgG2a升高更为显著,提示SPE乳液佐剂能提高Pgp3的特异性抗体水平,且SPE+Pgp3能诱导特异性Th1型免疫反应。

图3 各组免疫后小鼠血清IgG总抗体及亚类抗体水平的比较a为P<0.05,与Pgp3组比较。

2.4 各组脾淋巴细胞增殖的比较

6周时,SPE+Pgp3组SI(3.67±0.24)和Pgp3组SI(2.16±0.11)均明显高于PBS组(1.05±0.14)(P<0.05),且SPE+Pgp3组高于Pgp3组(P<0.05),说明SPE乳液佐剂能有效促进Pgp3蛋白特异性淋巴细胞增殖。

2.5 各组细胞因子的比较

SPE+Pgp3组和Pgp3组IFN-γ含量明显高于PBS组,且SPE+Pgp3组高于Pgp3组(P<0.001;图4),提示SPE乳液佐剂能有效促进细胞因子IFN-γ分泌。各组经刺激后仅检测到低水平IL-4(图4)。

图4 各组小鼠免疫后脾细胞上清细胞因子水平的比较a为P<0.001,与PBS组比较;b为P<0.001,与Pgp3组比较。

流式细胞术结果显示,Pgp3组、SPE+Pgp3组CD4+T细胞和CD8+T细胞的IFN-γ水平明显高于PBS组,且SPE+Pgp3组高于Pgp3组(P<0.05;图5),提示SPE乳液佐剂能有效促进CD4+和CD8+T细胞IFN-γ的分泌。

图5 小鼠免疫后流式细胞术检测脾细胞细胞因子水平a为P<0.05,与PBS组比较;b为P<0.05,与Pgp3组比较。

3 讨 论

Pgp3蛋白是衣原体致病的重要毒力因子,且具有较强的免疫原性[8],然而单独的蛋白抗原难以实现完全高效的细胞和体液免疫反应,需要合适的佐剂辅助增强其免疫效果。本实验将使用优化制备的SPE乳液作为佐剂,联合Pgp3蛋白制备成疫苗制剂,通过建立小鼠生殖道衣原体感染模型,探讨SPE乳液的免疫增强效果及机制,为Ct感染性疾病的防治提供实验依据。

Pickering乳液是指以固体粒子代替了表面活性剂分子来稳定的乳液[9],如铝佐剂、纤维素、聚苯乙烯[10]、壳聚糖、SiO2[11]等,其固体颗粒在水油界面上自组装,并在芯层固化后形成球形外壳。与传统乳液相比,Pickering乳液具有较高的安全性以及稳定性[12-13]。而一种理想的颗粒稳定剂应该具有较高的安全特性、容易获取、来源丰富及具有疏水性等优点[14],这些对于制备稳定安全的Pikering乳液非常重要。SiO2作为一种安全低毒且来源丰富的无机金属颗粒,具有强大的吸附能力且易溶于水,由于比表面积大,表面吸附能力强,经常用于吸附与分离[15],但由于本身特性难以收集,将其制备成Pickering乳液后可以更好地连接SiO2纳米粒子并使其稳定。因此,本实验选用了SiO2作为稳定剂,并使用不同条件制备SPE乳液以获得最优Pickering乳剂配方。

已有研究表明,粒径较小的纳米颗粒较粒径大的纳米颗粒能更快进入引流淋巴结,有利于适应性免疫反应的形成[16-17]。因此,合理调节纳米颗粒的粒径直径及其在注射部位停留的时间是优化制备Pickering乳液的关键。除此之外,Pickering乳液佐剂的水油比、纳米颗粒质量浓度以及超声功率也是制备出稳定均一乳液佐剂的重要参数[7]。本实验经上述一系列条件优化后的SPE乳液粒径小且均匀,能形成稳定的颗粒及水油相,是一种有潜力的蛋白装载和呈递的候选佐剂。优化后的SPE乳液佐剂可通过有效增强Pgp3抗原的吸收、促进细胞因子和趋化因子的增强及释放,有效募集单核细胞和粒细胞至肌肉注射部位,促进其被迁移至引流淋巴结[18-20],以辅助Pgp3蛋白实现高效细胞免疫及体液免疫。本实验使用优化后的SPE乳液佐剂联合Pgp3蛋白制备成疫苗制剂,以进一步增强Pgp3蛋白的免疫反应水平。

为观察联合疫苗制剂SPE+Pgp3的体液免疫水平,本实验采用了ELISA间接法检测各组特异性抗体的滴度,结果发现,随着免疫次数的增加,Pgp3组和SPE+Pgp3组小鼠抗体滴度均逐渐升高,且SPE+Pgp3组抗体滴度显著高于Pgp3组,说明SPE乳液佐剂能有效提高Pgp3蛋白的体液免疫水平。抗体亚型结果显示,SPE+Pgp3组IgG1与IgG2a均升高,且以IgG2a升高为主。IgG2a的产生高度依赖于Th1型[21-22]细胞分泌的IFN-γ和IL-2[23-24],而IgG1的产生则主要依赖于Th2细胞产生的IL-4,本实验联合疫苗制剂SPE+Pgp3组IgG2a的相对高水平说明其诱导的免疫反应偏向于Th1型。

淋巴细胞增殖反应是评估细胞免疫反应的重要指标,也能在一定程度上反映机体特异性细胞免疫功能,本实验采用CCK-8法检测各组脾淋巴细胞SI发现,与Pgp3组相比,SPE+Pgp3组脾淋巴细胞SI明显升高,说明SPE乳液佐剂能有效促进Pgp3蛋白特异性淋巴细胞的增殖。而抗衣原体感染的细胞免疫则主要依赖于CD4+Th1细胞反应[25-26],其中IFN-γ[27-28]为抗衣原体感染的关键因子。IFN-γ能控制机体内衣原体的载量,并能促进一氧化氮合酶的合成、超氧化物歧化酶以及色氨酸的催化,这些机制可能与机体杀灭衣原体相关[29]。研究证实,在机体感染过程中,CD8+T细胞同样会受到刺激并分泌IFN-γ,且CD8+T细胞能介导鼻内免疫后对Ct生殖道的跨黏膜保护性免疫[30]。本实验将脾淋巴细胞经特异性蛋白抗原刺激后,培养上清结果显示,Pgp3组与SPE+Pgp3组均产生较高水平IFN-γ,但SPE+Pgp3组产生的IFN-γ显著高于Pgp3组,说明SPE乳液佐剂能有效促进Pgp3蛋白进一步产生IFN-γ,增强机体细胞免疫应答水平;各组淋巴细胞培养上清中的IL-4水平较低,高水平的IFN-γ与低水平的IL-4进一步提示联合疫苗制剂诱导的免疫反应偏向于Th1型。为了进一步分析细胞因子IFN-γ的具体细胞来源,本实验将脾淋巴细胞经由BFA和cocktail刺激后,检测分析由CD4+T细胞与CD8+T细胞分泌的IFN-γ,结果显示,与PBS组相比,各组CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌的IFN-γ均明显升高,且SPE+Pgp3组显著高于Pgp3组,提示SPE乳液佐剂能有效促进CD4+与CD8+T细胞分泌IFN-γ。

总而言之,本实验优化制备的SPE乳液佐剂显著增强了Pgp3蛋白的细胞免疫应答及体液免疫应答,为Ct疫苗的研制提供了一种潜在的候选佐剂;但该疫苗制剂能否通过增强Pgp3蛋白疫苗的免疫反应以达到预防Ct感染防治的目的,还需要进一步实验来验证。