基于气相色谱-串联质谱指纹图谱与化学模式识别法鉴定不同品种药用红景天*

宋霞,刘亚蓉,李永鹏,卜晨琛,乔亚玲,王珺,张春平,吴立斌,海平

(青海省药品检验检测院,国家药品监督管理局中药藏药质量控制重点实验室/青海省中藏药现代化研究重点实验室,西宁 810016)

索罗玛布,汉语翻译为红景天,始载于《四部医典》,根据各地藏医用药索罗玛布均为景天科植物,共计3属10种,西藏各地藏医院以大花红景天为常用药材[1-2]。《晶珠本草》记载:“嘎都尔清热,治肺炎;可分为二品,上品根粗硬如圆穗蓼干燥根,下品外形和皮都像苏罗玛保(红景天),但味涩,各地藏医用景天科狭叶红景天等,外形和皮均像苏罗玛保,可视为正品”[2]。目前我国具有质量标准药用红景天共5种,红景天(大花红景天)收载于《中华人民共和国药典》2020年版一部[3],来源为景天科植物大花红景天Rhodiolacrenulata(Hook.f.et Thoms.)H.Ohba的干燥根和根茎。狭叶红景天(藏文名叫“力嘎都”或“尕都尔”)为藏族常用药,青海、甘肃、四川藏区等地区使用较多,现收载于《青海省藏药材标准》2020年版[4]、《四川省藏药材标准》2014年版[5]和《甘肃省中药材标准》2020年版[6]。唐古红景天主要分布在青海、甘肃、四川西部等地,《中国植物志》已将其名称修订为“唐古红景天”,学名Rhodiolatangutica(Maxim.)S.H.Fu,唐古特红景天作为红景天的一个来源收载于《藏药标准》(西藏、青海、四川、甘肃、云南、新疆卫生局合编)[7]和《青海省藏药炮制规范》[8]。高山红景天产吉林抚松、安图等长白山地区及黑龙江尚志、宁安、海林等县,现收载于《吉林省中药材标准》[9]和《浙江省中药材标准》[10]。长鞭红景天收载于《中草药与民族药药材图谱》[11]和《四川省藏药材标准》2020年版[12],经调研市场上俗称小花红景天,形态与大花红景天极其相似,常作为大花红景天的主要混淆品。全国第四次中药资源普查工作中,从青海省18个县普查到红景天属植物,并确定大花红景天、狭叶红景天和唐古红景天为青海当地藏医药用红景天的主要基原[13-14]。目前已有红景天指纹图谱或模式识别相关报道[15]。由于大花红景天、狭叶红景天、唐古红景天、长鞭红景天和高山红景天性状相似,药材市场和企业投料时常存在易混或人为掺杂现象,笔者在本研究采用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)建立GC-MS/MS指纹图谱和化学模式识别方法,以期为5种药用红景天的差异性研究提供参考。

1 材料

1.1仪器 GC-MS TQ8040气相色谱-质谱联用仪(三重四级杆检测器,日本岛津公司);NIST17质谱库;HH-6型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);XPR225型天平(梅特勒仪器上海有限公司,感量:0.01 mg);BSA224S-CW型天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司,感量:0.1 mg);ChemPattern2017先进化学计量学系统解决方案软件(科迈恩北京科技有限公司)。

1.2药品与试剂 没食子酸对照品(批号:110831-201906)、酪醇对照品(批号:111676-200602)、红景天苷对照品(批号:110818-202009)均购自中国食品药品检定研究院;大花红天素(批号:PS011097,CAS号:63026-02-8)购自成都埃法生物科技有限公司;水为超纯水;甲醇为色谱纯。不同品种红景天经青海省药品检验检测院刘亚蓉主任药师鉴定,样品来源见表1。

表1 红景天样品来源

2 方法与结果

2.1色谱条件

2.1.1气相色谱条件 采用5%二苯基95%二甲基聚硅氧烷为固定液的GC-MS/MS毛细管柱(0.25 mm ×30 m,0.25 μm);起始温度为50 ℃,维持2 min,以20 ℃·min-1的速率升温至300 ℃,维持10 min;进样口温度250 ℃;进样方式为分流进样,分流比为50。

2.1.2质谱条件 离子源为电子轰击离子源(EI 源),温度230 ℃;接口温度280 ℃;检测器电压相对于调谐结果0.7 kV;溶剂延迟时间3.5 min;扫描范围m/z50～500;载气为氦气,碰撞气为氩气;质谱扫描模式为MRM模式。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 分别取没食子酸对照品、酪醇对照品、红景天苷对照品和大花红天素对照品适量,精密称定,加甲醇制成每毫升各含0.2 mg的对照品溶液,即得。

2.2.2供试品溶液的制备 取本品粉末[过孔径(355±13) μm(三号)筛]约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,密塞,称定质量,加热回流1 h,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.3药材化合物GC-MS/MS数据库的建立 查阅狭叶红景天、大花红景天、唐古红景天、高山红景天、长鞭红景天的相关文献[16-24],整理并建立各药材的GC-MS/MS化合物数据库,包括化合物名称、分子式、精确相对分子质量及化合物结构等信息,建立的数据库为鉴别各品种红景天提供依据。自建的数据库中共收集大花红景天30个成分(其中确认没食子酸、酪醇、大花红天素、红景天苷4个成分),狭叶红景天34个成分(其中确认没食子酸、酪醇、红景天苷3个成分),唐古红景天26个成分(其中确认没食子酸、酪醇、红景天苷3个成分),高山红景天41个成分(其中确认没食子酸、酪醇、红景天苷3个成分),长鞭红景天27个成分(其中确认没食子酸、酪醇、红景天苷3个成分)。红景天苷、没食子酸、酪醇、大花红天素4个成分的GC-MS/MS质谱图见图1。

A.红景天苷;B.没食子酸;C.酪醇;D.大花红天素。

2.4GC-MS/MS指纹图谱方法学考察

2.4.1精密度实验 精密吸取“2.2.1”项对照品溶液,按“2.1”项色谱条件连续进样6次,以没食子酸色谱峰为参照峰(S),结果表明,在上述条件下混合对照品溶液保留时间的RSD均<0.3%,峰面积的RSD均<1.5%,表明该仪器精密度良好。

2.4.2重复性实验 取大花红景天样品(样品编号:DH-1)6份,按“2.2.2”项制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样,以没食子酸色谱峰为参照峰(S),计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示,各共有峰相对保留时间的RSD均<0.5%,峰面积的RSD均<2%,表明该方法重复性良好。

2.4.3稳定性实验 精密吸取大花红景天(样品编号DH-1)供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样,分别在 0,4,8,12,24,48 h 进样,以没食子酸色谱峰为参照峰(S),计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示,各共有峰相对保留时间的RSD均<0.3%,峰面积的RSD均<1.5%,表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.5GC-MS/MS指纹图谱建立及相似度评价

2.5.1GC-MS/MS指纹图谱建立 按“2.2.2”项下方法制备 5种药用红景天的供试品溶液,按 “2.1”项色谱条件进样,记录色谱图。采用ChemPattern2017先进化学计量学系统解决方案软件对色谱图进行分析,分别建立5种药用红景天的共有模式图,见图2。大花红景天共有模式中6号峰为没食子酸,7号峰为酪醇,17号峰为大花红天素(大花红景天独有特征峰),25号峰为红景天苷。狭叶红景天共有模式中9号峰为没食子酸,11号峰为酪醇,31号峰为红景天苷。唐古红景天共有模式中3号峰为没食子酸,4号峰为酪醇,16号峰为红景天苷。长鞭红景天共有模式中9号峰为没食子酸,10号峰为酪醇。高山红景天共有模式中4号峰为没食子酸,5号峰为酪醇,21号峰为红景天苷。通过建立5种药用红景天的GC-MS/MS指纹图谱,并建立各品种化合物数据库,对各品种的辨认提供鉴别依据。

A.大花红景天;B.狭叶红景天;C.唐古红景天;D.长鞭红景天;E.高山红景天。

2.5.2相似度评价 对分别建立的5种药用红景天进行相似度评价,各品种相似度见图3。结果大花红景天的相似度>0.80,狭叶红景天>0.45,唐古红景天>0.95,长鞭红景天>0.70,高山红景天>0.70。结果表明,狭叶红景天不同批次指纹图谱相似度差异较大,可能与其生长年份有关。

A.大花红景天;B.狭叶红景天;C.唐古红景天;D.长鞭红景天;E.高山红景天。

2.6GC-MS/MS定量测定方法学考察

2.6.1线性关系考察 分别精密吸取4种对照品溶液(没食子酸0.46 mg·mL-1,酪醇0.22 mg·mL-1、大花红天素0.71 mg·mL-1、红景天苷0.44 mg·mL-1)0.5,1,3,6,8,10 mL,分别置于10 mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,即得各系列浓度的单标溶液。分别精密吸取各系列浓度的标准溶液1 μL,注入气质联用仪,以各对照品进样量(μg)为横坐标(X),以峰面积为纵坐标(Y),进行线性回归,各对照品回归方程和线性范围见表2。

表2 4种化学成分的回归方程和线性范围

2.6.2精密度实验 精密吸取“2.2.1”项对照品溶液,按“2.1”项色谱条件连续进样6次,记录峰面积。结果没食子酸、酪醇、大花红天素、红景天苷峰面积的RSD分别为0.4%,0.2%,0.3%,0.6%,表明仪器精密度良好。

2.6.3重复性实验 取大花红景天样品(样品编号:DH-1)6份,按“2.2.2”项下制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样,记录峰面积并计算含量。结果各份供试品溶液的没食子酸、酪醇、大花红天素、红景天苷的测定结果RSD分别为1.2%,0.8%,1.0%,1.1%,表明该方法重复性良好。

2.6.4稳定性实验 精密吸取大花红景天(样品编号:DH-1)供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样,分别在 0,4,8,12,24,48 h 进样,记录峰面积。结果没食子酸、酪醇、大花红天素、红景天苷的峰面积的RSD分别为0.3%,0.5%,0.9%,0.7%,表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.6.5加样回收率实验 取已知含量的大花红景天(样品编号:DH-1)粉末(过三号筛)6份,每份各约0.25 g,精密称定,分别置25 mL具塞锥形瓶中,分别精密加入没食子酸对照品溶液(1.25 mg·mL-1)3.0 mL、酪醇对照品溶液(0.95 mg·mL-1)2.0 mL、大花红天素对照品溶液(1.12 mg·mL-1)2 mL、红景天苷对照品溶液(1.34 mg·mL-1)1.0 mL,精密加入甲醇17 mL,密塞,称定质量,加热回流1 h,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。在“2.1”项色谱条件下进样,记录峰面积并计算回收率,见表3,结果表明该方法加样回收实验结果良好。

表3 没食子酸、酪醇、大花红天素和红景天苷加样回收率实验结果

2.7GC-MS/MS定量测定结果 每个样品取2份,分别按“2.2.2”项制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进样,记录峰面积并计算含量,结果见表4。

表4 5种样品测定结果

2.8分类模式识别分析 将5种药用红景天和2批未知红景天的GC-MS/MS图谱数据经ChemPattern2017软件处理后进行分类模式识别分析,算法为K最近邻法(KNN),数据预处理方法为Pareto标度化,留一交叉验证,K数值为3,样本距离为欧式距离。分类模式识别图见图4。5种药用红景天作为训练集,2批未知红景天作为测试集。5种药用红景天分别聚集成一类,2批未知红景天为新疆购买的所谓蔷薇红景天,为切成较碎的饮片,难以从药材性状进行识别辨认,经测试1批为长鞭红景天,1批为狭叶红景天。处理后进行多元统计分析,采用正交偏最小二乘判别天。结果表明分类模式识别分析法对于未知样品的辨认具有一定的参考价值。

图4 分类模式识别分析图

2.9正交偏最小二乘分析(OPLS) 将5种药用红景天的GC-MS/MS图谱数据经ChemPattern2017版软件处理后进行多元统计分析,采用正交偏最小二乘判别法,样本距离为马式距离,设定VIP值为0.9,协方差阈值为0.1,相关性阈值为0.5,正交偏最小二乘判别分析差异性变量见表5,得到OPLS-V型图,得分矩阵图和OPLS-V型图见图5。样品可明显分为5组,其中大花红天素、酪醇和红景天苷的VIP值>0.9;结果表明5种药用红景天的GC-MS/MS数据差异特征明显。

图5 得分矩阵图和OPLS-V型图

表5 正交偏最小二乘判别分析差异性变量

2.10聚类分析 将5种药用红景天的GC-MS/MS图谱数据经ChemPattern2017软件处理后进行聚类分析,数据预处理方法为Pareto标度化,距离计算方法为街区距离,连接方法为误差平方和法。见图6,GC-MS/MS数据经聚类分析后分为两大类,大花红景天单独聚为一类,其余4种红景天聚为一大类。唐古红景天和长鞭红景天可单独聚为一小类,部分狭叶红景天和高山红景天混聚为一类,表明大花红景天与其余4种红景天差异特征明显,狭叶红景天和高山红景天存在一定的相似性。

图6 5种药用红景天的聚类分析图

3 讨论

3.1仪器方法的选择 本研究采用GC-MS/MS法建立5种药用红景天的指纹图谱,与HPLC和UPLC建立的指纹图谱比较,GC-MS/MS方法简便,分析时间更短,可重复性强,指纹图谱中各成分吸收强度高、各峰分离度良好且基线平稳,各色谱峰可以进行质谱确认。整理并建立5种药用红景天的GC-MS/MS化合物数据库,包括化合物名称、分子式、精确相对分子质量及化合物结构等信息,建立的数据库为鉴别各品种红景天提供依据。

3.2供试品溶液制备方法考察 分别考察甲醇、乙醇及不同比例的甲醇-水、乙醇-水为提取溶剂,以各共有指纹峰的数目、峰高为考察指标,结果显示以甲醇为提取溶剂时,共有指纹峰的数目最多,且峰高比适宜,因此选择甲醇为提取溶剂;考察甲醇超声和加热回流两种提取方式对指纹图谱的影响,以峰数及共有指纹峰“峰面积/称样量”为考察指标,结果显示加热回流提取时共有指纹峰的峰数最多且峰面积最大,因此选择加热回流提取方式;分别考察不同加热回流时间(30,45,60,90 min)对指纹图谱的影响,以共有指纹峰“峰面积/称样量”为考察指标,结果显示加热回流60和90 min时共有指纹峰的峰面积最高,因此选择加热回流60 min。

3.3建立方法对5种药用红景天及其混淆品的区分 红景天的混淆品多为其同属植物,原植物名称多为“××红景天”,在红景天不同产地,不同品种的红景天当地人统一称为“红景天”。不同品种红景天的原植物形态和药材及饮片性状极其相似。随着人们对红景天需求不断扩大,野生资源不断减少,加上大面积种植尚未成功,在实际流通和应用过程中常出现以不同品种掺入大花红景天中混用的情况。因此选择GC-MS/MS化学成分数据库、指纹图谱和化学模式识别相结合的方法对5种药用红景天及其混淆品可进行有效的辨识。

指纹图谱能比较全面地反映中药材所含的化学成分信息,进而反映中药材的整体质量以及近缘品种的差异性特征。实验结果表明,5种药用红景天的指纹图谱具有共有指纹峰,不同品种红景天存在差异性成分,如大花红景天中含有大花红天素,其余4种红景天均无该成分,因此大花红天素可以作为大花红景天的专属性成分进行识别。本实验引入化学模式识别法[25-28],分别通过分类模式识别分析、正交偏最小二乘分析和聚类分析将5种药用红景天加以区分,找到显著差异性标志化合物大花红天素、酪醇和红景天苷,能够作为区分5种红景天的依据,实验结果证明该方法准确可靠,专属性强,能够为5种药用红景天的区分和质量控制提供参考。