藏药四臣颗粒大鼠口服给药13周长期毒性研究*

高晓新,胡宇驰,赵晋燕,曹春然,张硕峰,李雪梅

(1.北京市药品检验研究院,国家药品监督管理局创新药物安全研究与评价重点实验室,中药成分分析与生物评价北京市重点实验室,北京 102206;2.北京市药品包装材料检验所,北京 100035;3.北京中医药大学中药学院,北京 100102)

四臣颗粒是西藏藏医药大学研制的复方制剂,处方组成为甘草、猪毛蒿、螃蟹甲、岩白菜等,功能主治为清热解毒、止咳平喘、润喉祛痰,用于治疗上呼吸道感染、慢性支气管炎急性发作,其药效作用得到相关研究证实[1-5]。此方人日用量拟定相当于生药材36.1 g,疗程为2周～1个月。参照国家食品药品监督管理局的《药物非临床研究质量管理规范》(局令第34号)[6]和 “药物重复给药毒性试验技术指导原则”[7],实验采用大鼠连续13周每天给药1次,观察供试品对大鼠的毒性反应,明确其毒性反应的症状和程度,确定其毒性靶器官和无毒反应剂量,为临床安全用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1供试品 四臣颗粒由A公司提供;批号:2101003,2110001;性状为黄棕色至棕色、带气香、味甜、微苦的颗粒;规格为每袋9 g(相当于生药18.05 g)。

1.2动物 无特定病原体(SPF)级SD大鼠128只,雌雄各半,雄鼠175.8～204.9 g;雌鼠159.9～189.2 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0011,动物使用许可证号:SCYK(京)2020-0041,实验动物质量合格证编号:110011211107447356,110011211107447436。饲养条件:屏障环境,温度20～26 ℃;相对湿度40%～70%,换气次数为>15次·h-1,照明时间是10 h(明)/14 h(暗)。

1.3主要试剂 测定试剂盒:葡萄糖(Glu,批号:AUZ8730);丙氨酸氨基转移酶(ALT,批号:AUZ8785);天冬氨酸氨基转移酶(AST,批号:AUZ8787);碱性磷酸酶(ALP,批号:AUZ9238);尿素(Urea,批号:AUZ9270);肌酐(Crea,批号:2625);总胆红素(T-BiL,批号:AUZ8983);总胆固醇(CHO,批号:AUZ7539);白蛋白(Alb,批号:AUZ9285);总蛋白(TP,批号:AUZ9297);三酰甘油(TG,批号:AUZ9154);肌酸激酶(CK,批号:AUZ9272);γ-谷氨酰基转移酶(GGT,批号:AUZ9172);以上血清生化及电解质分析相关试剂由贝克曼库尔特实验系统(苏州)有限公司及Beckman Coulter Inc生产。PEROX SHEATH(批号:51248),PEROX 1(批号:51250),PEROX 2(批号:51252),PEROX 3(批号:51254),HGB(批号:56812,05700),RBC/PLT(批号:81805,05693),BASO(批号:81803,05691),auto RETIC(批号:75550),EZ WASH(批号:47553),DEFOAMER(批号:24384,85486),SHEATH/RINSE(批号:71329);以上血液分析试剂是美国Siemens Healthcare Diagnostics Inc.生产。活化的部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒(批号:N1108457)、凝血酶原时间(AP)测定试剂盒(批号:N0100860),均由美国Instrumentation Laboratory Co.生产。尿分析阴性/阳性质控试纸(批号:C0338090),尿十项试纸[批号:(10)104061],尿液分析试剂由西门子医学诊断产品有限公司生产。

1.4主要仪器 Beckman AU480全自动生化仪(仪器编号:070010);ADVIA 2120i全自动血细胞分析仪(仪器编号:H11002);Clinitek Status尿液分析仪(仪器编号:060023);ACL ELITE PRO全自动血凝分析仪(仪器编号:090090),GFJY-01B交直流检眼镜(仪器编号:药19001);奥林巴斯BX53光学显微镜(仪器编号:190117)。

1.5实验方法 适应性饲养6 d后,按大鼠体质量随机分为阴性对照组(N)和四臣颗粒大(H)、中(M)、小(L)剂量组,N组灌胃纯化水,H、M和L组分别灌胃相当于生药33.12,20.98和8.83 g·kg-1(相当于拟定临床人用剂量的55,35和15倍)。每天上午给药1次,连续给药13周,停药恢复4周。体质量前4周每周测定2次、第5～13周每周测定1次;给药前和给药后0.5～4 h内各观察1次。摄食量每周测定1次。

给药结束,雄性L组9只,其余每组各10只,恢复4周后每组取大鼠6只留尿,眼科检查,取血并剖检留取标本,进行尿常规、血液学和血清生化学检测、脏器称定质量和组织病理学检查。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0版软件进行统计学分析。尿液学计数指标采用秩和检验;其他数据以均数± 标准差表示,首先进行方差齐性检验,如果方差不齐性进行Dunnett-t检验,如果方差齐进行单因素方差分析。血液学指标给药结束,雄性L组9只,其他组10只,恢复期各组6只。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1一般状况和眼科检查、体质量及摄食量

2.1.1大鼠一般状况及眼科检查 4组大鼠行为活动和外观体征等一般症状及眼科检查未见明显异常。给药期间L组雄性灌胃异常死亡大鼠1只。

2.1.2体质量 给药后0.5周,H组雌雄大鼠体质量增长缓慢(P<0.05),随着给药时间的延长,H组体质量增长更加缓慢(P<0.01),M组也逐渐出现体质量增长缓慢现象。停药后体质量逐渐恢复正常。见图1。

A.雄性;B.雌性。

2.1.3摄食量 给药期间雄性H剂量组第3—6周和第10周摄食量增加(P<0.05或P<0.01);雌性在给药第1周M、H组,第3周L组和第7周H组摄食量下降(P<0.05或P<0.01)。恢复期均无差异。见图2。

A.雄性;B.雌性。

2.2血液学和凝血指标 给药结束雄性H组RBC、HGB和HCT均降低(P<0.01),M组RBC降低(P<0.05)。雌性H组RBC、HGB、HCT、MCHC均降低(P<0.05或P<0.01)、MCV、MCH、RDW均升高(P<0.05或P<0.01),M组RBC降低、MCV和MCH升高(P<0.01)。各给药组RETIC存在剂量-效应相关性升高(P<0.01)。停药4周后雄性MCV、MCH升高(P<0.01),其余数值均恢复正常。给药结束凝血指标雄性H组PT升高(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠在不同期别血液学和凝血指标检测结果

2.3血清生化学和电解质 给药结束,与N组比较,雌性H组血糖升高(P<0.05),L、M、H组AST降低(P<0.05或P<0.01),H组CHO显著升高(P<0.01),雄性M、H组T-BiL升高(P<0.05)。恢复期,雄性H组GLU升高(P<0.01)。给药结束雌性大鼠血钾M组降低(P<0.05)、恢复期雄性H组升高(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠在不同期别血清生化和电解质指标结果

2.4尿液学检查结果 给药结束雄性M、H组胆红素显著升高(P<0.05),具有剂量-效应关系,见表3。个别组其他指标如尿比重、潜血和白细胞有统计学差异,但无生物学意义。

表3 4组大鼠不同期别尿胆红素的变化

2.5脏器系数 给药结束雄性给药组肝脏系数增大(P<0.05或P<0.01),雌性M,H组肝脏系数增大(P<0.01);雄性M、H组肾脏、雌性H组肾脏系数增大(P<0.01)。雄性个别组脑、睾丸、附睾差异有统计学意义,但不具有生物学意义。恢复期所有脏器系数均差异无统计学意义。见表4。

表4 4组大鼠在不同期别脏器系数指标检测结果

续表4 4组大鼠在不同期别脏器系数指标检测结果

2.6组织病理学 给药结束各给药组胸骨和股骨骨髓出现极轻到中度的红系造血功能明显活跃,且具有剂量-效应关系;各给药组脾脏髓外造血增多,雄性有剂量-效应关系。H组部分肾小管上皮细胞内存在极轻到轻度的棕黄色大小不等的色素颗粒。停药4周上述病变完全恢复。见图3—4。

A.N组;B.L组; C.M组;D.H组。

A.N组;B.H组。

3 讨论

藏药四臣颗粒连续灌胃大鼠13周,给药期间中、大剂量组体质量增长缓慢,雌性大剂量组摄食量减少、雄性大剂量组摄食量却增多。上述现象说明,雌性因给药浓度和体积偏大影响摄入量而导致体质量增长缓慢,雄性体质量增长缓慢则可能与灌胃四臣颗粒影响营养物质的正常吸收利用有关。给药结束M、H组RBC、HGB、HCT等多个红系相关指标显著降低,但在正常值范围内[8],不能诊断为贫血,但动物营养摄入和吸收利用受到供试品的影响,初步推断动物会有因营养不良而影响红系造血的可能。给药组反应性RETIC升高且超过正常值,以及组织病理学检查中髓内外造血增多,都验证可能会形成营养不良性贫血[9]。恢复期雄性MCV、MCH差异有统计学意义,但在正常值范围内,无生物学意义。

雄性M、H组及雌性H组肾脏系数显著增大(P<0.01),组织病理学检查发现H组部分动物肾小管上皮细胞内存在极轻到轻度的棕黄色大小不等的色素颗粒;但肾功能指标未见异常。这与文献报道的肾脏的组织病理学病变一般先于临床病理学指标出现[10],实验室动物常规HE染色可观察色素沉积的病理变化相同[11]。恢复期肾脏改变完全恢复。本研究中供试品为黄棕色至棕色中药,推测肾脏改变为供试品色素重复给药在肾脏沉积所致,与供试品毒性无关,但提示长期使用需要监测肾功能指标。

给药结束给药组肝脏系数不同程度增大,结合供试品清肝利胆作用[5]、动物体质量增长缓慢、肝脏组织病理和血液生化却无异常改变等综合判断,与供试品无直接毒性相关。给药结束雄性M、H组血清T-BiL升高(P<0.05),但数值在正常范围内,可能与供试品清肝利胆的作用有关[5];产生多排除多,导致相应组动物尿胆红素显著升高,没有毒理学意义。个别组其他指标,如尿的比例、潜血和白细胞、血糖、PT、血钾变化无生物学意义。

综上所述,藏药四臣颗粒大鼠灌胃给药13周,RETIC的升高和髓内外造血增多平衡红系中RBC、HGB、HCT等指标降低,使其在正常值范围内。另外,H组肾小管上皮细胞棕黄色颗粒为中药色素重复给药在肾脏沉积所致。初步判断,大鼠灌胃13周四臣颗粒相当于生药33.12 g·kg-1及以下剂量没有明显毒性。长期服用四臣颗粒可影响大鼠营养物质摄入和吸收利用以及肾脏色素沉积,建议严格控制临床用药时间,同时监测血液学和肾功能相关指标。