云南白药促进骨折愈合作用及其机制*

刘凤丽,万仲贤,罗丽华,胡兴荣,吴波

(1.湖北民族大学医学部,恩施 445000;2.湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院药学部,恩施 445000;3.湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院放射科,恩施 445000)

现代医学认为,骨折愈合过程包含血肿炎症机化期、原始骨痂形成期、骨痂改造塑形期[1-2]。具有消肿止痛、活血化瘀、强筋健骨功效的中药,可缩短骨折愈合的炎症机化期,促进骨折部位血管再生、骨痂形成,对骨折愈合具有促进作用[3-7]。云南白药主要组成药物有三七、重楼、麝香、金铁锁、草乌、白芨、冰片、披麻草等[1],具有活血化淤、止血定痛、解毒消肿、补血生新等作用,用于治疗跌打损伤、软组织挫伤、闭合性骨折等。前期临床研究从器官与组织水平揭示了云南白药促进骨折愈合的药理作用,但分子水平上的疗效与机制研究有待进一步深入,本课题组拟通过X线检测骨折进程,以酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中对骨形成具有促进作用的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、骨钙素(osteocalcin,OC)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor,VEGFA)、 Ⅰ型前胶原N 端肽(procollagen I N-Terminal propeptide,PINP)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和酸性磷酸酶5(acid phosphatase 5,ACP5)等蛋白浓度[8-19],采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色与免疫组化等方法观察云南白药促进骨折愈合药理作用及其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 普通级新西兰家兔26只,雄性,体质量2.0～2.3 kg[湖北省逸挚诚生物科技有限公司提供,实验动物合格证:SCXK(鄂)2016-0020],家兔饲养于三峡大学动物实验中心,饲养条件:相对湿度(55±5)%、温度20～25 ℃,自由进食、饮水。饲料由湖北省逸挚诚生物科技有限公司提供。本实验由三峡大学实验动物福利与伦理委员会批准(No.L2018172)。

1.2试药 云南白药粉(云南白药集团股份有限公司,规格:每瓶4 g,批号:ZAA2014);苯巴比妥注射液(天津金耀药液有限公司,批号:2012231);蜂蜜(福建省神蜂科技公司,批号:2021032501)。ACP5、OC、VEGFA、TNF-α、IL-6、bFGF、PINP、ALP的ELISA检测试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司);无机磷、钙测定试剂盒(长春汇力生物技术有限公司);豚鼠抗兔血管内皮生长因子A多克隆抗体(CLOUD-CLONE CORP.,PAA143Rb51)。

1.3仪器 电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司,型号:XPR106DUH/AC,感量:0.002 mg);台式高速冷冻离心机(北京大龙兴创实验仪器股份公司,型号:D1524R);全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技,型号:chemray160);咬骨钳( 恩施市兴达医疗器械有限公司,订制) ;ELx808酶标仪(美国Biotek公司);Logiq E9彩色多普勒超声诊断仪(美国GE公司);DR仪( 荷兰飞利浦公司,启明星);石蜡切片机(金华科迪仪器设备有限公司,型号:KD-2258);生物组织摊片机(金华科迪仪器设备有限公司,型号:KD-P);生物组织包埋一体机(金华科迪仪器设备有限公司,型号:KD-BM&BL);HE染色套装(武汉百杰康生物科技有限公司,型号:RE1100);显微镜(OLYMPUS公司,型号:CKX41);成像系统(MshOt MD50);组织切片全景扫描仪(3DHISTECH)。

1.4云南白药的处理 将云南白药与炼蜜按1：4比例调配成糊状,密封保存至少1周,待药物化学成分充分释放后使用。

1.5动物造模 将新西兰家兔按随机数字法抽选16只,固定后用苯巴比妥钠经耳缘静脉麻醉(1.2 mL·kg-1),在家兔左侧前肢备皮、消毒。沿桡骨前内侧,以桡骨中、下1/3段交界处为中心,依次切开皮肤、浅筋膜、深筋膜,钝性分离肌肉,暴露桡骨。以咬骨钳造成桡骨中段5 mm骨缺损,保持尺骨完整。0.9%氯化钠溶液冲洗。逐层缝合,包扎伤口,无外固定,拍DR片以检验造模是否成功。术后3 d肌内注射青霉素40万U,每天1次。

1.6动物分组与给药方法 将造模成功的家兔12只随机分为云南白药组和模型对照组,另设正常家兔6只为正常对照组。造模成功1 d后,云南白药组:按5 g·kg-1剂量将云南白药均匀涂抹在无菌纱布块上,厚度0.3～0.5 mm,将载药无菌纱布用夹板外固定在造模部位对侧面,每3 d换药1次;模型对照组与正常对照组:以同样大小夹板包扎固定,夹板更换时间同云南白药组。

1.7观察指标及检测方法

1.7.1X线检测骨折愈合进程 造模当天和药物干预第1,2,3,4周末,通过DR仪X 线观察骨痂阴影情况,观察骨折线模糊、消失时间,以及骨髓腔贯通时间。

1.7.2血清钙磷检测与ELISA检测 造模当天及药物干预第1,2,3,4周末,经静脉采血2～2.5 mL,4 ℃下1500 r· min-1离心5 min(r=40 cm),取上清液,按试剂盒说明书操作方法测定血清钙、磷浓度,ELISA法检测IL-6、TNF-α、OC、VEGFA、PINP、bFGF、ALP、ACP5浓度。

1.7.3骨折愈合及母细胞bFGF表达情况 干预4周后处死兔,以骨折处为中心取桡骨段1 cm,剔除软组织,取骨折部位标本,将样本固定、脱钙、包埋、切片、烤片后备用。将样本石蜡切片脱蜡至水,依次完成苏木精染色、伊红染色、树胶封片,显微镜镜检,组织切片全景扫描仪获取数码照片;将样本石蜡切片经二甲苯及乙醇梯度脱蜡至水,分别完成抗原修复、内源性过氧化物酶灭活、特异性位点的封闭、一抗二抗孵育、二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)染色、苏木精染核、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)返蓝、脱水透明、树胶封片,显微镜镜检,组织切片全景扫描仪获取数码照片,采用Caseviewer软件任意采集5个视野,Imagej软件统计5个视野染色阳性面积比。

2 结果

2.1骨折愈合进程 结果见图1。模型对照组桡骨骨折线造模后第3周变得模糊,第4周消失;骨折愈合处骨组织第4周开始增厚;骨折处骨髓腔第4周未形成。云南白药组桡骨骨折线造模第2周开始变得模糊,第3周骨折线消失;骨折处骨组织第4周完成增厚,骨髓腔开始形成和贯通。与模型对照组比较,云南白药组骨折愈合速度与进程均快1周。

图1 两组不同时间左前肢桡骨DR检测结果

2.2血清钙、磷及钙磷乘积检测结果 模型对照组血清钙造模后逐渐升高,造模后第2周达峰值,第3周开始下降;血清磷造模后第2周逐步升高,造模第4周升至1.822 mmol·L-1;血清钙磷乘积造模后先升高后降低,造模后第2周达峰值,见表1。云南白药组血清钙造模后第1周达到峰值,且较模型对照组高(P<0.05);血清磷造模后一直升高,造模后第2周开始明显较模型对照组高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型对照组比较,云南白药组钙磷乘积自造模后1周开始更高,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 3组兔不同时间血清钙、磷、钙磷乘积检测结果

2.3TNF-α与IL-6含量测定结果 见表2。模型对照组造模当天血清TNF-α与IL-6浓度最高,之后呈下降趋势;云南白药组血清TNF-α与IL-6浓度呈下降趋势,与模型对照组比较下降趋势更显著。

表2 3组兔不同时间血清TNF-α与IL-6测定结果

2.4ELISA检测结果 见表3。模型对照组血清OC、VEGFA、PINP、bFGF、ALP浓度造模当天最低,之后呈上升趋势;云南白药组血清OC、VEGF、PINP、bFGF、ALP浓度呈上升趋势,与模型对照组比较上升趋势更为显著。模型对照组血清ACP5造模后先呈上升趋势,造模后第1周达峰值,之后呈较为平缓下降趋势;云南白药组血清ACP5呈先升高后降低趋势,造模后第1周达峰值,与模型对照组比较下降趋势更明显。

表3 3组兔不同时间OC,VEGFA,PINP,bFGF,ALP和ACP5检测结果

2.5骨折部位愈合情况 见图2。HE染色结果显示,模型对照组以软骨细胞正向骨痂转化并产生数量众多而孔径较小的骨髓腔为主,有小部分骨开始钙化;云南白药组已经完成软骨向骨痂转化,骨髓腔全部形成,部分骨髓腔相互贯通并有序排列,较多骨开始钙化,产生微小血管。

图2 2组兔骨折部位HE染色结果

2.6骨折部位骨母细胞bFGF表达情况 见图3。云南白药组中,骨母细胞在新产生的骨髓腔内和骨小梁周围呈有序致密排列,呈长圆卵形。模型对照组5个视野平均染色阳性面积比为0.65%,云南白药组1.81%,正常对照组0.4%,云南白药组与模型对照组、正常对照组比较,均差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 2组兔骨折部位骨母细胞bFGF表达情况

3 讨论

X线检测结果显示,与模型对照组比较,云南白药组新西兰兔桡骨骨折愈合进程提前1周时间,说明云南白药对新西兰兔骨折愈合具有促进作用;骨折部位HE染色结果从骨形成组织与细胞水平说明云南白药可以提前软骨向骨痂转化、骨髓腔形成与贯通、骨钙化进程和微小血管形成的进程与时间。血清钙磷及乘积检测结果说明,云南白药可以通过提高血清钙及钙磷乘积峰值、提前血清钙峰值来促进骨折愈合。血清中TNF-α和IL-6的ELISA检测结果说明,云南白药对炎症具有良好的抑制作用,这可以抑制骨折早期血肿形成时的过度炎性反应,缩短骨折愈合血肿炎症机化期。进一步对促进骨形成的ALP、OC、ACP5、VEGFA、bFGF、PINP等蛋白进行检测发现,云南白药可以快速促进ALP、OC、ACP5、VEGFA、bFGF升高,这提示云南白药具有促进骨形成作用,利于更早形成原始骨痂。通过IHC检测bFGF来研究云南白药对骨母细胞的形成与功能的影响,发现云南白药具有促进骨母细胞形成作用,进而促进成骨细胞形成与功能活跃。

综上所述,云南白药对骨折愈合期的炎性反应具有显著抑制作用,并可以促进血管生成和骨再生,使骨折愈合进程提前,对骨折愈合有促进作用。骨折愈合是一个十分复杂的过程,其对血管形成和骨折愈合的积极作用是由某种药材或是多种药材相互作用的共同结果及其具体关系等问题需要进一步研究和完善。云南白药有草乌、披麻草等有毒成分,其外用可能存在过敏反应、中毒反应、创面炎症反应及出血反应等不良反应,本实验未进行肝功能、肾功能、血小板等血清学的药物安全性检测是不足之处。