藏药诃子化学成分的高效液相色谱-质谱联用技术快速鉴定研究＊

简 平，亓 旗，周 坤，梁文仪，梁林金，叶 婷，张兰珍

（北京中医药大学中药学院 北京 102488）

诃子是使君子科植物诃子Terminalia chebular Retz.及其变种绒毛诃子Terminalia chebula Retz.var.tomentella Kurt.的干燥成熟果实。别名诃黎勒、诃梨，藏医、蒙医称“阿如拉”，泰语称“麻菜果”，原产于印度、缅甸，在我国云南、广东、广西、西藏等地也有分布。具有涩肠止泻，敛肺止咳，降火利咽之功效[1]。诃子主要含有鞣质、酚类、苯丙素类、黄酮和三萜类等多种化学成分，具有抗氧化、抗炎、抗病原微生物、抗肿瘤等作用[2]。目前尚未有液质联用鉴定分析诃子中化学成分的报道。

本研究首次采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-LTQ-Orbitrap MS）对诃子提取物中化学成分进行在线分离分析研究，根据其分子离子以及特征碎片离子的精确质荷比，结合标准品、文献数据[3-13]等方法鉴定诃子提取物中的化学成分，并对它们可能的质谱裂解模式进行归纳，以期对诃子的质量控制、药效物质基础及化学成分的快速鉴定提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LTQ-Oribitrap XL线性离子阱-串联静电场轨道阱质谱仪：美国Thermo Scientific公司产品，配有热喷雾离子源（HESI）、Xcalibur 2.1化学工作站（美国thermo公司）；Thermo Scientific Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused超高液相色谱系统：含二元梯度泵，自动进样器，柱温箱，DAD检测器；Chromeleon 7工作站。Millipore Synergy UV型超纯水机（美国Millipore公司）；Sartorious BT 25S型万分之一电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；超声波清洗器（北京中晟名科技有限公司，100 W）；0.22 μm微孔滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）；甲醇（质谱纯，Fisher公司）；乙酸（色谱纯，天津市丰越化学品有限公司）。

图1 诃子提取物的总离子流图（负离子模式）

诃子药材产于西藏，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果实；没食子酸（批号141109）购于成都普菲德生物技术有限公司、没食子酸甲酯（批号160105）购于北京四面体生物科技有限公司、柯里拉京（批号MUST — 1051301）、鞣花酸（批号MUST — 15091807）均购于成都曼思特生物科技有限公司、诃子鞣酸（批号Z06D5B2）购于上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.2%醋酸的水溶液(A)，甲醇溶液(B)；梯度洗脱条件：0-10 min(5%-15%B)，10-15 min(15%-25%B），15-30 min(25%-30%B)，30-50 min(30%-60%B)，50-55 min(60%-90%B)，55-62 min(90%-90%B)；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：30℃；检测波长：270 nm。

1.2.2 质谱条件

HESI离子源，负离子检出模式，离子源温度350℃，电离源电压4 KV，毛细管电压：35 V，管透镜电压：110 V，鞘气和辅助气均为高纯氮气（纯度＞99.99%），鞘气流速：40 arb，辅助气流速：20 arb；数据采用傅里叶变换高分辨全扫方式（TF，Full scan，Resolution 30000）数据依赖性（data-dependent acquisistion）ddMS2和ddMS3；母离子列表（Parent ion list）PIL-MS2和PIL-MS3；并运用CID和HCD（高能量碰撞）相结合的碎解方式等多种策略。

1.2.3 供试品溶液的制备

称取诃子药材粉末约0.2 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入50%甲醇20 mL，超声提取50 min，静置冷却，补足原重量。摇匀，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

1.2.4 对照品溶液的制备

精密称定对照品没食子酸2.1 mg，没食子酸甲酯2.1 mg，柯里拉京2.0 mg，诃子鞣酸2.1 mg，置 10 mL量瓶中加甲醇溶解，定容，摇匀。精密称定鞣花酸对照品2.3 mg，置10 mL量瓶中加DMSO溶解，定容，摇匀，即得对照品溶液。

2 结果

按照1.2节方法分析诃子提取物，由于诃子所含化学成分主要为酚酸、可水解鞣质、黄酮等酸性化合物，选择负离子模式，得到其在负离子模式下的总离子流图（图1）。根据检测得到的各化学成分保留时间、精确质谱信息，并结合提取离子流图与标准品信息、Scifinder数据库及相关文献对其进行成分确认，共鉴定了62个成分，包括60个酚酸和鞣质，2个三萜类（峰61，62）。其中，通过与对照品比对鉴定的化学成分有：没食子酸（gallic acid）、没食子酸甲酯（methyl gallate）、柯里拉京（corilagin）、诃子鞣酸（chebulagic acid）、鞣花酸（ellagic）acid。峰5，19，20，26，31，34，35，38，44，45，51，53，55和峰59为首次从藏药诃子中发现。详情列于（表1）。

2.1 酚酸类化合物鉴定

1号峰保留时间为2.91 min，其分子离子峰为m/z 191[M—H]—，该离子失去一个中性碎片H2O（18u）产生碎片离子m/z 173[M-H—H2O]—，失去一个中性碎片CO（28u）和2个H2O（18u）产生碎片离子 127[M —H—CO—2H2O]—。根据元素组成分析，推测分子式为C7H12O6，相对分子质量理论值为191.0550，实测值为191.0554。1 号峰被推测为 quinic acid[14，15]。

表1 诃子提取物中的主要化学成分

续表1

2号峰保留时间为3.46 min，其分子离子峰为m/z 173[M—H]—，失去一个中性碎片H2O（18 u）产生碎片离子m/z 155[M—H—H2O]—。根据元素组成分析，推测分子式为C7H10O5，相对分子质量理论值为173.0444，实测值为173.0450。2号峰被推测为Shikimic acid[5]。

通过标准品比对，结合文献数据[14，17]，峰9和60被鉴定为gallic acid和ellagic acid。gallic acid分子离子峰为m/z 169[M—H]—，gallic acid失去一个中性碎片CO2(44 u)产生碎片离子m/z 125[M—H—CO2]—。根据元素组成，其分子式为C7H6O5，相对分子质量理论值为169.0131，实测值为169.0138；ellagic acid的分子离子峰为m/z 301[M—H]—，特征碎片离子m/z 603[2M— H]—，ellagic acid失去一个中性碎片 H2O（18 u）产生碎片离子m/z 283[M—H—H2O]—，m/z 257[M-HCO2]—为其失去一个中性碎片CO2（44 u）产生的碎片离子。根据元素组成，推测分子式为C14H6O8，相对分子质量理论值为300.9979，实测值为300.9984。

2.2 简单没食子酰酯类化合物鉴定

简单没食子酰类化合物，其特征碎片离子源于失去没食子酰基部分(-galloyl，-152 u)而产生。以54号峰为例，保留时间为38.61 min，其分子离子峰为m/z 939[M—H]—，依次失去一个没食子酰基(152 u)，从而形成的系列碎片离子有：m/z 787[M—H—galloyl]-，m/z 635[[M—H—2galloyl]-，m/z 483[M—H—3galloyl]-，m/z 331[M—H—4galloyl]-，m/z 179[M—H—5galloyl]-。根据元素组成，推测分子式为C41H32O26，相对分子质量理论值为m/z 939.1098，实测值为m/z 939.1105。54号峰被推测为pentagalloylglucose。

39，46，47 ，49和52号峰的保留时间分别为23.81min，32.02 min，32.85 min，34.90 min和35.80 min，其分子离子峰均为m/z 787[M—H]—。根据元素组成，推测其分子式为C34H28O22，相对分子质量理论值为m/z 787.0988，39号峰实测值为m/z 787.0994，峰46实测值为m/z 787.0995，47号峰实测值为m/z 787.0991，49号峰实测值为m/z 787.1004，52号峰实测值为m/z 787.1002。根据其依次失去一系列没食子酰基，结合简单没食子酰类化合物的特征碎片，39，46，47，49和52号峰被推测为tetragalloylglucose及其同分异构体；36，40，42号峰的保留时间分别为22.35，24.11和24.90，其分子离子峰均为m/z 635[M—H]—。根据元素组成，推测其分子式为C27H24O18，相对分子质量理论值为635.0879，36号峰实测值为635.0883，40号峰实测值为635.0886，42号峰实测值为635.0880。根据简单没食子酰类化合物的特征碎片，被推测为triglloylglucose及其同分异构体。

13，15，17 ，22-24，27，28，30，33号峰的保留时间分别为 11.80 min，14.10 min，14.60 min，16.22 min，17.21 min，17.54 min，18.81 min，19.07 min，19.51 min和20.80 min，其分子离子峰为m/z 483[M—H]—。根据元素组成，推测其分子式为C20H20O14，相对分子质量理论值为m/z 483.0769，13号峰实测值为m/z 483.0785，15号峰实测值为m/z 483.0782，17号峰实测值为m/z 483.0784，22号峰实测值为m/z 483.0776，23号峰实测值为m/z 483.0778，24号峰实测值为m/z 483.0778，27号峰实测值为m/z 483.0785，28号峰实测值为m/z 483.0779，30号峰实测值为m/z 483.0778，33号峰实测值为m/z 483.0785。结合简单没食子酰类化合物的特征碎片，被推测为digalloylglucose及其同分异构体。

6，8，11 号峰的保留时间分别为6.84 min，8.28 min和9.98 min，其分子离子峰为m/z 331[M—H]—。根据元素组成，推测其分子式为C13H16O10，相对分子质量理论值为m/z 331.0660，6号峰实测值为m/z 331.0666，8号峰实测值为m/z 331.0668，11号峰实测值为m/z 331.0667。结合简单没食子酰类化合物的特征碎片，被推测为 glucogallin 及其同分异构体[14，17，18]。以 glucogallin为例，说明简单没食子酰酯类化合物的裂解方式：m/z 331[M—H]-为其分子离子峰，失去一个中性碎片C4H8O4(120 u)产生碎片离子m/z 211[M—H—C4H8O4]—，失去一个没食子酰基(152 u)产生碎片离子m/z 179[M—galloyl]—，失去一个中性碎片C6H10O5(162 u)产生没食子酸碎片m/z 169[M—H—C6H10O5]—，失去一个中性碎片C6H10O5的基础上，再失去一个中性碎片CO2(44 u)产生碎片离子m/z 125[M—H—C6H10O5— CO2]—。

32号峰的保留时间为19.82 min，其分子离子峰为m/z 183[M—H]—，失去一个CH3（15u）中性碎片形成碎片离子m/z 168[M—H—CH3]—，再失去一个CO2（44u）形成碎片离子m/z 124[M—H—CH3-CO2]—。根据元素组成，推测其分子式为C8H8O5，相对分子质量理论值为m/z 183.0288，实测值为m/z 183.0296。峰32被鉴定为methyl gallate，这与其标准品碎裂信息一致。

2.3 鞣质类化合物鉴定

鞣花鞣质由于其结构中具有HHDP部分，碎片离子m/z 301是其典型特征。5，19，43号峰的保留时间分别为6.45 min和25.55 min，其分子离子峰为m/z 633[M—H]—和m/z 1267[2M—H]—，失去一个没食子酰基产生碎片离子m/z 481[M—H—galloyl]—，继续失去一个H2O（18u）产生碎片离子m/z 463[M—H—galloyl—H2O]—。根据元素组成，推测其分子式为C27H22O18，相对分子质量理论值为m/z 633.0722，峰5实测值为m/z 633.0728，19号峰实测值m/z 633.0726，峰43实测值m/z 633.0723。该化合物失去332 u形成m/z 301(HHDP)碎片离子，这表明其结构中含有一个galloylglucose(332 u)单元。因此5，19，43号峰被鉴定为galloyl—HHDP—glucose及其异构体[16，19]，进一步与对照品比较，43号峰被鉴定为corilagin。

图1 诃子鞣质类部分化合物结构图

20，26，31 和55号峰的保留时间分别为15.30 min，18.85 min和19.64 min，38.90 min，分子离子峰为m/z 785[M—H]—，该离子连续失去没食子酰基产生碎片离子m/z 633[M—H—galloyl]—、m/z 481[M—H—2galloyl]—，继续失去一个中性碎片H2O（18u）产生碎片离子m/z 463[M—H—2galloyl—H2O]—。根据元素组成，推测其分子式为C34H26O22，相对分子质量理论值为m/z 785.0832，20号峰实测值为m/z 7785.0841，26号峰实测值为m/z 7785.0839，31号峰实测值为m/z 785.0831，55号峰实测值为m/z 785.0842。结合特征碎片离子m/z 300(HHDP)，20，26，31和55号峰被推测为digalloyl—HHDP—glucoses[23]。然而仅凭MS，MS/MS和UV等手段，仍无法区分tercatain及其同分异构体。

34号峰的保留时间为21.24 min，分子离子峰为m/z 951[M—H]—，该离子失去一个中性碎片H2O（18u）产生碎片离子m/z 933[M—H—H2O]—。根据元素组成，推测其分子式为C41H28O27，相对分子质量理论值为m/z 951.0734，实测值为m/z 951.0736。结合文献数据与特征碎片m/z 301[21]，34号峰被推测为geraniin。

3号峰，分子离子峰为m/z 481[M—H]—，失去一个葡萄糖产生碎片离子m/z 301(HHDP)。根据元素组成，推测其分子式为C20H18O14相对分子质量理论值为m/z 481.0613，实测值为m/z 481.0623。3号峰被初步推测为HHDP—glucose。14和21号峰的保留时间分别为12.02 min和15.38 min，分子离子峰为m/z 1083[M—H]—，失去一个鞣花酸单元产生碎片离子m/z 781[M—H—ellagic acid]—，继续失去一个葡萄糖产生碎片离子m/z 601[M—H—ellagic acid—glu]—。根据元素组成，推测其分子式为C48H28O30，相对分子质量理论值为m/z 1083.0582，14号峰实测值为m/z 1083.0571，21峰实测值m/z 1083.0569。结合特征碎片离子m/z 541[M— 2H]2—、m/z 301(DPPH)，14和21号峰被推测为punicalagin。反相色谱中，α—punicalagin比β—punicalagin先出峰。所以14号峰被推测为α—punicalagin，21号峰被推测为为β—punicalagin。对应于punicalagin的裂解碎片m/z 781[M—H—ellagic acid]—，7和10号峰的分子离子峰为m/z 781[M—H]—，保留时间分别为7.82 min和8.28 min，失去一个葡萄糖碎片产生碎片离子m/z 601[M—H—glu]—。根据元素组成，推测其分子式为C34H22O22，相对分子质量理论值为m/z 781.0519，7号峰实测值为m/z 781.0526，峰10实测值m/z 781.0523。结合碎片离子m/z 301(DPPH)，7和10号峰被推测为punicalin及其同分异构体[20]。

16和18号峰的保留时间分别为14.39 min和14.76 min，分子离子峰为m/z 783[M—H]—，结合文献数据[22]，特征碎片离子有m/z 391[M — 2H]2—，m/z 631，m/z 451，m/z 299。根据元素组成，推测其分子式为C34H24O22，相对分子质量理论值为m/z 783.0675，16号峰实测值为m/z 783.0674，18号峰实测值为m/z 783.0681。16和18号峰初步推测为terflavin B及其异构体。25号峰在保留时间15.43—18.41 min范围内出现了一个宽峰，表明其可能由几个同分异构体组成，分子离子峰为m/z 1085[M—H]—。根据元素组成，推测其分子式为C48H30O30，相对分子质量理论值为m/z 1085.0738，25号峰实测值为m/z 1085.0732，结合文献数据[22]，25号峰被初步推测为terflavin A。

m/z 337[Chebulic acid—H—H2O]—是诃子次鞣质类化合物的特征碎片，是由诃子次鞣质的基本结构单元诃子次酸(Chebulic acid)分子内失去一个中性碎片H2O形成，该类化合物的特征碎片还有m/z 319[Chebulic acid— H — H2O — H2O]—，m/z 293[Chebulic acid—H — H2O-CO2]—，m/z 275[Chebulic acid— H — H2O— H2O — CO2]—。

35和38号峰的保留时间分别为21.68 min和23.33 min，分子离子峰为m/z 971.10[M—H]—。根据元素组成，推测其分子式为C41H32O28，相对分子质量理论值为m/z 971.0996，35号峰实测值为m/z 971.1001，38号峰实测值为m/z 971.1005，结合特征碎片离子m/z 953[M — H — H2O]—，m/z 935[M — H — 2H2O]—，m/z 467[M—2H—2H2O]2—，初步推测其为neochebulagic acid及其异构体[19]。

44号峰的保留时间为27.91 min，分子离子峰为m/z 989[M—H]—。根据元素组成，推测其分子式为C41H34O29，相对分子质量理论值为m/z 989.1102，实测值为m/z 989.1109。结合特征碎片离子m/z 494[M—2H]2-，m/z 337。峰44被推测为chebuloyl neochebuloyl galloylglucose[19]。

45和51号峰的保留时间为29.02 min和35.30 min，分子离子峰为m/z 803[M—H]—，该离子失去一个中性碎片没食子酸后产生碎片离子m/z 633[M—H—gallic]—，该离子失去一个没食子酰基产生碎片离子m/z 651[M-H-galloyl]—，继续失去一个没食子酸中性碎片形成m/z 481[M—galloy—gallic]—。根据元素组成，推测其分子式为C34H28O23，相对分子质量理论值为m/z 803.0938，45号峰实测值为m/z 803.0944，51号峰实测值为m/z 803.0945。结合其特征离子m/z 337，m/z 319，m/z 293，m/z 275，m/z 401[M — 2H]2—，45和51号峰被推测为digalloyl—chebuloyl—glucose及其同分异构体[22]。

53号峰的保留时间为37.67 min，分子离子峰为m/z 973[M—H]—，连续失去没食子酰基产生碎片离子m/z 821[M — H — galloy]—、m/z 669[M — H — 2galloy]—、m/z 517[M—H—3galloy]—，失去一个没食子酰后继续失去一个没食子酸中性碎片产生碎片离子m/z 651[M—H—galloy—gallic]—。根据元素组成，推测其分子式为C41H34O28，相对分子质量理论值为m/z 973.1153，实测值为m/z 973.1148。结合特征碎片m/z 337，53号峰被推测为neochebulinic acid。

图2 诃子鞣质类、酚酸类部分化合物结构图

48和59号峰的保留时间分别为34.04 min和43.35 min，分子离子峰为m/z 953[M—H]—，该离子失去一个羧基形成碎片离子m/z 454[M—H—COOH]2-。根据元素组成，推测其分子式为C41H30O27，相对分子质量理论值为953.0891，48号峰实测值为953.0881，59号峰实测值为953.0898。根据文献数据结合特征离子有 m/z 476[M — 2H]2—，m/z 633，m/z 463，m/z 300(DPPH)，二者初步被鉴定为galloyl chebuloyl—HHDP-glucose[17，19]，进一步与标准品对比，48 号峰被鉴定为chebulagic acid。

峰4和12的保留时间为5.26 min和10.80 min，分子离子峰为m/z 355[M—H]—。依据特征离子m/z 337[M—H—H2O]—、m/z 711[2M—H]—。根据元素组成，推测其分子式为C14H12O11，相对分子质量理论值为m/z 355.0296，峰4实测值为m/z 355.0292，峰12实测值为m/z 355.0302。因此4和12号峰被初步鉴定为chebulic acid及其异构体[17，19]。峰37，保留时间为 23.15 min，分子离子峰为m/z 683[M—H]—，失去一个没食子酸中性碎片产生碎片离子m/z 513[M—H—gallic]—，失去一个没食子酰基后产生碎片离子m/z 531[M—H—galloyl]—，继续失去一个没食子酸中性碎片产生碎片离子m/z 351[M—H—galloyl—gallic]—。根据元素组成，推测其分子式为C28H28O20，相对分子质量理论值为m/z 683.1090，实测值为m/z 683.1096。因此，峰37被初步推测为 methyl neochebulanin[16，19]。

29和41号峰的保留时间分别为19.40 min和24.60 min，分子离子峰为m/z 651[M—H]—。根据元素组成，推测其分子式为C27H24O19，相对分子质量理论值为m/z 651.0828，实测值为m/z 651.0828。结合特征碎片离子m/z 633[M—H—H2O]—，29和41号峰被初步推测为chebulanin及其同分异构体。

50号峰的保留时间为35.09 min，分子离子峰为m/z 985[M—H]—，失去一个CH2（14u）中性碎片产生碎片离子m/z 971[[M—H—CH2]—，失去一个没食子酸中性碎片和没食子酰基后产生碎片离子m/z 633[M—galloy—gallic]—。根据元素组成，推测其分子式为C42H34O28，相对分子质量理论值为m/z 985.1153，50号峰实测值为m/z 985.1148。结合文献数据和特征碎片离子m/z 492[M — 2H]2—，m/z 351[methyl neochebulate—H—H2O]—，50号峰被推测为methyl neochebulagate及其同分异构体[22]。

56和57号峰的保留时间分别为40.23 min和40.97 min，分子离子峰为m/z 987[M—H]—。根据元素组成，推测其分子式为C42H36O28，相对分子质量理论值为m/z 987.1309，实测值为m/z 987.1308。依据文献数据和特征碎片m/z 973[M—H—CH2]—，m/z 493[M—2H]2—，m/z 351[methyl neochebulate— H — H2O]—，56和57号峰被推测为methyl neochebulinate及其同分异构体[22]。

58号峰的保留时间为41.32 min，分子离子峰为m/z 955[M—H]—，连续失去没食子酰基产生碎片离子m/z 803[M — galloyl]—、m/z 651[M — 2galloyl]—、m/z 499[M—3galloyl]—，失去3个没食子酰基后继续失去一个葡萄糖产生碎片离子峰m/z 319[M—3galloyl—glu]-。根据元素组成，推测其分子式为C41H32O27，相对分子质量理论值为m/z 955.1047，实测值为m/z 955.1030。因此，58号峰被推测为chebulinic acid[17]。

2.5 三萜类化合物鉴定

在负离子模式下，61和62号峰其分子离子峰为m/z 503[M—H]—，该离子脱去CO2（14u）形成碎片离子m/z 459[M-H-CO2]—。根据元素组成分析，两者分子式为C30H48O6，相对分子质量理论值为m/z 503.3367，实测值为m/z 503.3378和m/z 503.3373。卢普平等人从诃子乙醇提取物中分离得到的三萜类化合物有arjungenin，分子式均为C30H48O6，其相对分子质量为m/z 503.3367，与所测数据一致，因此初步推测61和62号峰为arjungenin及其同分异构体。

3 总结与讨论

本实验采用HPLC—MS技术对诃子提取物的化学成分进行研究，通过高分辨质谱中精确分子质量归属出元素组成，分析裂解碎片信息，结合标准品信息及相关文献共鉴定出62种化学成分，主要为可水解鞣质类。其中，14个化合物为首次从诃子中鉴定得到。分析了已鉴定化合物的质谱碎裂途径，推测出酸类和可水解鞣质类化学成分的质谱裂解规律，可为中药化学成分及其类似物质的结构解析提供参考。