miR-26a-5p 影响肝癌细胞迁移和侵袭的机制研究

范巍巍 曹萌 魏清筠

在中国，肝癌是高发性恶性肿瘤，手术切除是目前临床治疗的主要手段，但术后5 年复发率高达40%～60%，严重威胁患者的生命健康[1]。肝癌的发生、发展是一个由多基因参与的、多步骤、多阶段的由体内外多因素相互作用的复杂过程，涉及编码和非编码基因结构和表达水平的异常。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年来研究较多的一类非编码基因，异常表达的miRNA 可能在肝细胞癌变中发挥重要作用，与肝癌转移复发、预后和治疗等紧密相关[2-4]。Li 等[5]发现，miR-26a-5p 在肿瘤组织和细胞中均异常低表达，过表达miR-26a-5p 可有效抑制肿瘤细胞的增殖生长。Ji 等[6]发现，肝癌患者miR-26-5p 的表达水平与IL-6 的表达呈负相关，而IL-6 可通过多条信号通路直接或间接影响肿瘤进程，提示miR-26a-5p 可能通过影响IL-6 相关的信号传导途径对肝癌的发生、发展起调控作用。本研究检测miR-26a-5p 和IL-6 在多种肝细胞中的表达情况，分析过表达miR-26a-5p 对肝转移性腺癌细胞SK-HEP-1 转移和侵袭能力的影响，验证miR-26a-5p与IL-6 基因的靶向作用关系，探讨其可能的分子机制，以期为肝癌复发、转移提供有价值的分子诊断标志物。

1 材料和方法

1.1 细胞和试剂

1.1.1 实验细胞及培养 人肝细胞株LO2，人肝癌细胞株HepG2、BEL-7402、SMMC-7721，高转移性肝癌细胞株MHCC97H，肝转移性腺癌细胞株SK-HEP-1，均购自富衡生物科技（上海）有限公司。所有细胞均培养于37 ℃，含5%二氧化碳（CO2）的细胞培养箱内，使用含10% FBS、100 U/ml 青霉素及100 U/ml 链霉素的高糖（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培养基。0.25%胰酶消化传代，倒置显微镜观察细胞生长状态。所有实验均在江苏省中医药研究院完成。

1.1.2 主要试剂 miR-26a-5p 模拟物和模拟物对照购自中国百奥迈科生物技术有限公司，批号分别为BH0930 和BIO82201。Transwell 小室（批号：2144016）购自美国Millipore 公司，Matrigel 基质胶（批号：356237）购自美国Corning 公司。pMIR-REPORT ™miRNA 表达报告基因载体系统（批号：AM5795）购自美国ThermoFisher 公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒（批号：E1910）购自美国普洛麦格生物技术有限公司。Trizol 提取试剂（批号：15596018）购自美国ThermoFisher 公司。MiPure 细胞miRNA 提取试剂盒、逆转录试剂和SYBR Green 实时荧光定量PCR 试剂盒均购自中国诺唯赞生物科技股份有限公司，批号分别为RC201、R323-01、Q712-02。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（批号：P0010）购自中国碧云天生物技术有限公司。信号转导和转录激活因3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）抗体、磷酸化STAT3（phospho- STAT3，p-STAT3）抗体、波形蛋白（Vimentin）抗体、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体均购自美国CST 公司，批号分别为4904T、9145T、5741S、3195T、5174T。辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗（批号：20000626）购自Proteintech 公司。IL-6 ELISA 试剂盒（批号：100802）购自美国R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 6 种细胞miR-26a-5p 表达的检测 采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）法。使用miRNA 提取试剂盒提取细胞总miRNA，采用茎环法逆转录合成cDNA，根据SYBR Green qRT-PCR 试剂盒说明书方法检测细胞miR-26a-5p 相对表达量，以U6 作为内参。miR-26a-5p 引物序列：逆转录CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCCTATC，F-5'-ACACTCCAGCTGGGTTCAAGTAATCCAGGA-3'，R-5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6 引物序列：F-5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R-5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.2 6 种细胞IL-6 mRNA 表达的检测 使用Trizol试剂提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书方法逆转录合成cDNA。根据SYBR Green qRT-PCR 试剂盒说明书方法检测细胞中IL-6 mRNA 的相对表达量，以GAPDH为内参。采用2-ΔΔCt法计算IL-6 mRNA相对表达量。IL-6 mRNA引物序列：F-5'-GGCACTGGCAGAAAACAACC- 3'，R- 5'- GCAAGTCTCCTCATTGAATCC- 3'；GAPDH 引物序列：F-5'-TCAGTGGTGGACCTGACCTG-3'，R-5'-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3'。

1.2.3 细胞转染 以1.2.1 中miR-26a-5p 表达水平最高的细胞株作为转染细胞。取对数生长期细胞调整密度至1.5～2.0×105/孔，接种于6 孔板中培养过夜。待细胞达到50%融合度时，将培养基更换为不含双抗的DMEM 培养基。使用miR-26a-5p模拟物和模拟物对照分别转染细胞，分为miR-26a-5p 模拟物组和模拟物对照组；以转染空脂质体组细胞为空白对照组，共3 组。转染4～6 h 后，将培养基更换为含10%FBS 的DMEM 培养基，37 ℃继续培养48 h，用于后续实验。

1.2.4 转染细胞中IL-6 表达的检测 采用ELISA 法。1.2.3 中各组细胞培养72 h 后，收集细胞培养液上清液，稀释后加入酶标板中。根据ELISA 试剂盒说明书方法，测定450 nm 时的光密度，以空白显色孔为对照，根据标准品所测的结果，绘制“吸光值-浓度”曲线，计算3 组细胞培养液上清液中IL-6 质量浓度。

1.2.5 转染细胞荧光素酶活性的检测 采用双荧光素酶报告实验。通过工具网站TargetScan 预测分析miR-26a-5p 与IL-6 的碱基结合位点。将野生型（Wt）的IL-6 3'-非编码区（untranslated region，UTR）的序列扩增到pMIR-Report 荧光素酶载体系统的下游位点，引物序列：F- 5'- CTATATTTTTAAGAAGTACCACTTGAAACATTTA- 3'，R- 5'- AGCTTAAATGTTTCAAGTGGTACTTCTTAAAAATATAGAGC-T-3'，构建荧光素报告基因质粒。设计定点突变引物，将结合位点中种子序列TT突变为AA，引物序列：F-5'-CTATATTTTTAAGAAGTACCACAAGAAACATTTA- 3'，R- 5'- AGCTTAAATGTTTCTTGTGGTACTTCTTAAAAATATAGAGCT- 3'，构建靶点突变型（Mut）报告基因质粒。将转染细胞以2.0×104/孔的密度接种于24 孔板中，实验分为6 组：miR-26a-5p 模拟物组、模拟物对照组、空白对照组、miR-26a-5p 模拟物+空载质粒组、miR-26a-5p 模拟物+ Wt 质粒组、miR-26a-5p 模拟物+ Mut 质粒组。共转染48 h 后，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒方法裂解细胞，检测并计算细胞荧光素酶相对活性。

1.2.6 转染细胞迁移能力的检测 采用细胞划痕实验。将1.2.3 中3 组细胞调整密度至2×105/ml 接种于6 孔板中，待细胞达到50%融合度时，用无菌枪头在单层细胞上直线划痕，PBS 清洗，分别于0 和48 h 时倒置显微镜观察并拍照。重复3 次实验，每次2 个复孔。对拍照视野中迁移过原划线的细胞进行计数，用Image J 软件测量两侧细胞的间距。

1.2.7 转染细胞侵袭能力的检测 采用Transwell 法。在24 孔Transwell（膜孔径8 mm）的上室加入1 g/L 的基质胶70 μl，37 ℃放置60 min 后形成基底膜结构。取1.2.3 中3 组细胞，以无血清培养基将细胞密度调整为1×105/ml，取200 μL 细胞悬液接种于上室，下室加入含10% FBS 的DMEM 培养基500 μl，37 ℃，5% CO2培养24 h 后，棉签抹去滤膜上层细胞，甲醇固定。结晶紫染色15 min。重复3 次实验，光镜观察拍照，计数穿过膜的细胞数。

1.2.8 转染细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蛋白表达的检测 采用Western blot法。收集1.2.3各组细胞，裂解后，4 ℃12 000 r/min 离心15 min 收集总蛋白。根据BCA 试剂盒方法测定蛋白含量，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），湿法转膜，5%脱脂牛奶封闭后，加入STAT3、p-STAT3、E-cadherin、Vimentin、GAPDH 等一抗，4 ℃孵育过夜；PBS 溶液洗膜3 次，加入HRP 二抗，室温孵育1 h。采用化学发光法，滴加ECL 显影液进行荧光显影，拍照保存。以鼠GAPDH 单抗作为内参，使用Image J图像处理软件分析目的条带的灰度值，计算目的蛋白相对表达量=目的条带灰度值/GAPDH 灰度值。

1.2.9 EMT 相关基因mRNA 表达的检测 采用qRTPCR 法。收集1.2.3 各组细胞，参照1.2.2 方法提取总RNA，并逆转录成cDNA，qRT-PCR 法扩增mRNA。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算相关基因mRNA 相对表达量。E-cadherin 蛋白的编码基因CDH1 引物序列：F-5'-GCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAG-3'，R-5'-TGGCAGTGTCTCTCCAAATCCG-3'；N-cadherin 蛋白的编码基因CDH2 引物序列：F-5'-CCTCCAGAGTTTACTGCCATGAC-3'，R-5'- GTAGGATCTCCGCCACTGATTC-3'；Snail 蛋白的编码基因SNAI1 引物序列：F-5'-TGCCCTCAAGATGCACATCCGA-3'，R-5'-GGGACAGGAGAAGGGCTTCTC-3'；Slug 蛋白的编码基因SNAI2引物序列：F-5'-ATCTGCGGCAAGGCGTTTTCCA-3'，R-5'-GAGCCCTCAGATTTGACCTGTC-3'。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0 统计软件，计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6 种细胞miR-26a-5p 和IL-6 mRNA 相对表达量的比较 相比LO2，BEL-7402、SMMC-7721、MHCC97H和SK-HEP-1 细胞中miR-26a-5p相对表达量均显著降低（均P＜0.05），其中SK-HEP-1 细胞中miR-26a-5p 相对表达量最低，见图1A。相比LO2，BEL-7402、SMMC-7721 和SK-HEP-1 细胞中IL-6 mRNA 相对表达量显著升高（P＜0.05），其中SK-HEP-1 细胞的IL-6 相对表达量最高，见图1B。因此后续实验以SK-HEP-1作为研究对象。

图1 6 组细胞miR-26a-5p 和IL-6 mRNA 相对表达量的比较（A：miR-26a-5p；B：IL-6）

2.2 3 组转染细胞中miR-26a-5p 和IL-6 表达的比较与模拟物对照组比较，miR-26a-5p 模拟物组细胞中miR-26a-5p相对表达量显著升高（P＜0.01），可用于后续功能试验分析；miR-26a-5p 模拟物组IL-6 mRNA 和蛋白相对表达量均显著降低（均P＜0.05）。空白对照组和模拟物对照组miR-26a-5p、IL-6 mRNA 和蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图2。

图2 转染细胞中miR-26a-5p和IL-6表达的比较（A：miR-26a-5p相对表达量；B：IL-6 mRNA 相对表达量；C：IL-6蛋白相对表达量）

2.3 转染miR-26a-5p 细胞荧光素酶活性的比较TargetScan 预测发现，IL-6 mRNA 的3'-UTR 存在miR-26a-5p 高度保守的靶向结合位点，见图3A。与模拟物对照组比较，miR-26a-5p 模拟物组IL-6 3'-UTR 荧光素酶相对活性显著降低（P＜0.05）；空白对照组和模拟物对照组荧光素酶相对活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与miR-26a-5p 模拟物+Mut 质粒组比较，miR-26a-5p 模拟物+Wt 质粒组IL-6 3'-UTR 荧光素酶相对活性显著降低（P＜0.05）；miR-26a-5p 模拟物+Mut 质粒组和miR-26a-5p 模拟物+空载质粒组比较，荧光素酶相对活性差异无统计学意义（P＞0.05），见图3B。说明miR-26a-5p 与靶基因IL-6 mRNA 3'-UTR 的结合作用是序列特异的。

图3 miR-26a-5p 与IL-6 mRNA 3'-UTR 的靶向结合关系（A：Wt 和Mut IL-6 3'-UTR 与IL-6 mRNA 的潜在结合位点示意图；B：6 组细胞荧光素酶相对活性的比较）

2.4 3 组转染细胞迁移能力的比较 相比空白对照组和模拟物对照组，miR-26a-5p 模拟物组细胞迁移数量显著降低（P＜0.01），细胞间划痕的距离显著增大（P＜0.01），见图4。提示miR-26a-5p 抑制细胞迁移。2.5 3 组转染细胞侵袭能力的比较 与模拟物对照组比较，miR-26a-5p 模拟物组细胞侵袭数显著减少（P＜0.01）；空白对照组和模拟物对照组细胞侵袭能力比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图5。

图4 miR-26a-5p 对细胞迁移的影响（A：划痕实验检测48 h 后3 组细胞迁移情况，×40；B：3 组细胞迁移数量比较；C：3 组细胞间划痕距离比较）

图5 miR-26a-5p 对细胞侵袭的影响（A：Transwell 实验检测3 组细胞的侵袭能力，×100；B：3 组细胞侵袭数比较）

2.6 3 组细胞STAT3 蛋白磷酸化水平和EMT 相关蛋白表达的比较 与模拟物对照组相比，miR-26a-5p 模拟物组p-STAT3/STAT3 表达水平显著降低（P＜0.01），模拟物对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示STAT3 蛋白水平基本不变，但p-STAT3蛋白水平降低，见图6A-B。与模拟物对照组相比，miR-26a-5p 模拟物组E-cadherin 表达水平显著增加，Vimentin 表达水平显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图6C-D。

图6 miR-26a-5p 对细胞STAT3 蛋白磷酸化及EMT 相关蛋白表达的影响（A：3 组细胞STAT3 和p-STAT3 蛋白电泳图；B：3 组细胞STAT3 和p-STAT3 蛋白相对表达量比较；C：3 组细胞E-cadherin 和Vimentin 蛋白电泳图；D：3 组细胞E-cadherin 和Vimentin 蛋白相对表达量比较）

2.7 3 组细胞EMT 相关基因mRNA 表达的比较 与模拟物对照组相比，miR-26a-5p 模拟物组细胞中CDH1 mRNA 表达水平显著升高，CDH2、SNAI1、SNAI2 mRNA表达水平显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图7。

图7 3 组细胞EMT 相关基因mRNA 表达的比较

3 讨论

miR-26a-5p 全长22 nt，其表达失调与多种肿瘤演进过程有关[4-5]。研究发现，肝癌组织的miR-26a-5p 表达显著低于癌旁肝组织，且低表达的患者预后较差，总生存率低[6]。miR-26a-5p 在肝癌组织和细胞中均异常低表达，过表达miR-26a-5p 可有效抑制肝癌细胞的增殖和迁移[7-10]。miR-26a-5p 的下调与肝癌患者肿瘤复发、转移和预后不良显著相关。Yang 等[11]发现，肝癌患者miR-26a-5p 表达水平与IL-6 表达呈负相关；联合检测miR-26a-5p 和IL-6 可作为判断总生存期的独立预后指标。TargetScan 预测发现，IL-6 mRNA 的3'-UTR 是高度保守的miR-26a-5p 的靶向区。推测miR-26a-5p 可能通过参与IL-6 相关的信号传导途径对肝癌的发生、发展起调控作用[12-13]。

Trohatou 等[9]在体外培养HepG2 细胞时加入IL-6，结果发现原癌基因（v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog，c-Myc）激活，miR-26a-5p 的表达被抑制。与钱建升等[14]和Ma 等[15]发现的过表达miR-26a-5p 可抑制HepG2 和SMMC-7721 的增殖和迁移的结果一致。但要注意的是，不同肝癌细胞中miR-26a-5p 和IL-6 的表达水平不同[16]。本研究检测并比较了miR-26a-5p 和IL-6 mRNA 在正常人肝细胞和人肝癌细胞系中的表达情况，结果发现HepG2 中miR-26a-5p高表达，IL-6 mRNA 几乎不表达，而SK-HEP-1 刚好相反。使用化学合成miR-26a-5p 模拟物转染SK-HEP-1，结果发现胞内miR-26a-5p 相对表达量显著升高，IL-6 mRNA 相对表达量显著降低，IL-6 蛋白相对表达量也相应降低。双荧光素酶报告基因实验证实了miR-26a-5p 与IL-6 mRNA 3'-UTR 存在靶向关系，且两者结合存在序列特异性。划痕实验和Transwell 实验进一步证实，过表达miR-26a-5p 能显著抑制肝癌细胞迁移和侵袭。

IL-6 是肿瘤微环境中一种含量丰富的多能性细胞因子，通过Janus 激酶（Janus-activated kinase，JAK）/STAT 和NF-κB 等信号通路对肿瘤发生、发展产生直接或间接作用[17-20]。IL-6 信号激活会引起JAK 磷酸化，并诱导下游关键信号STAT3 磷酸化，活化的STAT3形成二聚体转移入核，激活调控基因的转录活性，从而发挥生物学效应[21]。研究发现，大多数肝细胞癌患者体内IL-6/STAT3 信号异常激活[22-23]。IL-6/STAT3 信号不仅对原发性肝癌有影响，还会通过形成促转移生态位造成肿瘤转移，导致继发性肝癌[24]。故STAT3 被认为是介导IL-6 功能的最主要转录因子。EMT 是上皮细胞去分化转化为间充质表型的生物学过程，被普遍认为参与了肝癌的早期转移进程[25-26]。EMT 发生时，上皮细胞分子标志物E-cadherin 表达降低，间质细胞分子标志物Vimentin 表达增加[27]。Zhang 等[28]在人肝癌细胞株SMMC-7721 和MHCC97H 中过表达STAT3，结果发现E-cadherin 表达显著下调，Vimentin 表达显著上调，进一步STAT3 信号传导通路在肝癌侵袭和转移过程中起重要作用[29-30]。

本研究在高转移肝癌细胞SK-HEP-1 中过表达miR-26a-5p，结果发现肝癌细胞迁移和侵袭被有效抑制，其可能机制是通过靶向抑制IL-6 mRNA，下调STAT3 磷酸化，升高上皮标志E-cadherin 表达和降低间质标志Vimentin 表达。即过表达miR-26a-5p 通过IL-6/STAT3 轴抑制肝癌细胞的迁移和侵袭，可能是治疗肝癌转移的潜在策略。