儿童百日咳实验室诊断的研究进展

马富艳

百日咳是一种具有高度传染性的呼吸道急性感染病，临床多见于儿童，具有病程周期长、易出现严重并发症等特点[1]。百日咳疫苗在20 世纪已被纳入国家免疫规划，在实施计划免疫后，百日咳的发病率大幅降低，但近年来多个国家又出现了反弹现象，发病人数逐年增加，即“百日咳再现”[2]。一方面，百日咳疫苗的次优效应及有限的保护期限被认为是“百日咳再现”的主要原因[3]，另一方面，百日咳鲍特杆菌耐药性的增加及其抗原成分的改变也可能是百日咳死灰复燃的原因之一[4]。需要注意的是，由于缺乏典型的临床表现，百日咳发病初期症状与普通感冒极为相似，且典型病例较少，临床极易漏诊和误诊，导致病情加重，威胁患儿身心健康[5]。因此，采取及时有效的诊断对百日咳后期干预治疗和预防具有重要指导意义。基于此，本文就百日咳实验室诊断的研究进展作一综述，总结国内外实验室检查方法诊断百日咳的优缺点，为规范制定百日咳实验室诊断标准提供参考。

1 百日咳的病因及临床症状

1.1 病因 百日咳主要由百日咳鲍特杆菌感染引发[6]。除此之外，副百日咳鲍特菌、支气管炎鲍特菌和霍氏鲍特菌等也是引起百日咳的主要病菌[6-7]。百日咳鲍特杆菌分泌的“毒力因子”包括百日咳毒素（pertussis toxin，PT）、百日咳黏着素（pertactin，PRN）、丝状血凝素（filamentous haemagglutinin，FHA）、气管细胞毒素（trachealcytotoxin，TCT）、凝集原（agglutinogen，AGG）、腺苷酸环化酶毒素（adenylcyclasetoxin，ACT）、脂多糖内毒素（lipopolysacchairide，LPS）和百日咳菌毛蛋白（fimbriae，Fim）等。目前PT、PRN、FHA 和AGG 已被作为保护性的抗原成分用于无细胞百日咳疫苗的研制[8-9]，其中PT 为百日咳鲍特菌特有抗原，特异性较其他抗原更高，在百日咳发病中起关键作用[9-10]。研究表明，PT 不仅促进百日咳杆菌黏附于呼吸道纤毛上皮细胞使之变性、坏死，还可使患者淋巴组织中的淋巴细胞扩散到周围血液及气管；另外，PT 可抑制中性粒细胞迁移和募集以及使病原体避开抗体介导的清除作用，从而加强了病原体在呼吸道的黏附能力[11]。

1.2 临床症状 百日咳分为卡他期、痉咳期和恢复期3 个阶段[12]。卡他期（1～2 周）传染性最强，与无症状的普通感冒类似，出现低热、咳嗽、打喷嚏、流泪等症状，咳嗽开始为单声的干咳，3～4 d 后热退，夜晚咳嗽重[13]。痉咳期（2 周～2 个月）的典型标志是阵发性、痉挛性的咳嗽伴有大量的黏液，发出鸡鸣样吸气吼声，常出现涕泪交流、面色涨红、唇色发绀、反射性呕吐等症状。阵咳剧烈时，可出现鼻出血、咯血及眼结膜下出血等，甚至发生颅内出血，经常有并发症出现，如肺炎、百日咳脑病、肺动脉高压等[14]。恢复期（2～3 周）咳嗽发作次数减少，程度减轻，不再出现阵发性痉咳，鸡鸣样吸气声消失[15]。青少年和成人多表现为无症状，但在患病期间易传染给儿童。此外，接种百日咳疫苗的儿童并不能完全避免患病，随着年龄增长，体内抗体水平下降，在4～5 岁后较易发病，但由于疫苗仍存在保护作用，症状只有较长时间的咳嗽，很难和普通咳嗽区分[16]。

2 百日咳的实验室检查方法

2.1 外周血常规和涂片检查 白细胞和淋巴细胞数量明显增高可作为百日咳的诊断标准之一。唐小利等[3]回顾性分析发现，23 例住院百日咳患儿血常规检查WBC 中位值为21.4×109/L，其中有14 例超过20.0×109/L（约60.9%），有3 例（13.0%）超过30.0×109/L；WBC＞25.0×109/L 患儿的住院时长和再次感染概率均高于WBC＜20×109/L 的患儿。外周血淋巴细胞对百日咳也具有重要诊断价值[17]。戎红辉等[18]分析160 例疑似百日咳患儿的实验室指标后发现，确诊患儿淋巴细胞百分比显著高于未确诊患儿。王军等[19]回顾性分析857 例百日咳患儿的临床资料后发现，81.9%患者以淋巴细胞增高为主。提示淋巴细胞数和WBC 增高是重症百日咳的高危因素。《中国儿童百日咳诊断及治疗建议》提出对于≤3 月龄患儿，临床诊断时加上外周血WBC≥20.0×109/L 伴淋巴细胞比例≥60%可确诊。但在临床实践中，朱慧慧等[20]对124 例≤3 月龄百日咳患儿诊断WBC 发现仅有52 例（41.94%）符合上述标准，由此提出对于此年龄段的患儿在百日咳诊断时可适当下调WBC 的阈值。可见虽然血常规是简单易行的实验室检查，但将外周血常规作为实验室确诊指标仍有一定局限性，现行诊断标准尚待进一步验证和完善。

最新研究认为，在外周血涂片中发现裂隙淋巴细胞可能是简单、快速的诊断百日咳的方法[21]。陈奕颖等[22]对80 例疑似百日咳患儿进行分组比较发现，裂隙淋巴细胞阳性的22 例患儿中有21 例确诊为百日咳，特异度达97.5%。许秀妆等[21]在52 例百日咳患儿中均观察到数量不等的裂隙淋巴细胞，而55 例非百日咳患儿中均未见到，提示外周血裂隙淋巴细胞计数在早期筛查百日咳中存在重要作用。此外，一项对裂隙细胞及外周血T 淋巴细胞亚群在百日咳患儿中的表达探究发现，裂隙细胞及外周血T淋巴细胞亚群均与百日咳严重程度显著相关（P＜0.05），可一定程度反映百日咳的严重程度，并提示疾病分期[23]。虽然外周血涂片观察裂隙淋巴细胞诊断方法简单易行，可以在基层医院全面开展，但也存在一定的限制，要求技术人员能够熟练掌握细胞形态学。

2.2 细菌培养 细菌培养并分离百日咳鲍特杆菌的特异性高，被WHO 列为实验室诊断百日咳的标准之一，是百日咳诊断的“金标准”。在严重的病例中可见百日咳鲍特杆菌存在于下呼吸道，但其首选的定植地点是上呼吸道，因此鼻咽取样是最佳方法[24]。吕曦等[25]采集159 例慢性咳嗽患儿鼻咽拭子进行百日咳鲍特菌培养，结果检测出百日咳患儿39 例；分离病菌菌株并检测对各类抗生素的敏感性后发现，阿莫西林可能成为大环内酯类抗生素耐药菌株感染的备选药物。同样地，陈鑫等[26]以96 例确诊百日咳患儿为研究对象，经细菌培养检出病原菌119 株，且对青霉素类和头孢菌素类抗菌药物敏感性较高。李玥等[27]采用细菌培养方式检测864 例百日咳患儿的鼻咽拭子标本，检出百日咳鲍特菌阳性样本208 例，占送检患儿总数的24.1%，特异度为79.0%，高于荧光定量PCR 的59.0%。张喆等[28]采集1 029 例临床疑诊为百日咳的患儿鼻咽拭子，培养发现，百日咳鲍特杆菌有211 例（20.5%）阳性，7 月份的分离率最高，为31.2%，与WHO 调查报告所展示的月份一致。研究发现，在患儿已使用抗生素、接种疫苗、既往感染、病程较长或样本保存运送条件不当等因素影响下，检出率仅为0～30%[29]。由此可见，细菌培养的检测方法灵敏度较低，且可能因各实验室样本采集、转运、分离培养、鉴定等诸多环节的差异有所不同。此外，由于实验操作周期较长（3～7 d），目前细菌培养法已很少用于临床百日咳诊断，但该方法在分离百日咳鲍特菌及药物敏感性检测方面仍有重要意义[30]。

2.3 血清学方法

2.3.1 ELISA 法 血清学方法诊断百日咳在欧洲及澳大利亚等地区和国家已被广泛使用，ELISA 法是其中最主要的血清学方法[30]。Otsuka 等[31]开发新型ELISA试剂盒用于测定血清百日咳抗体Vag8-IgM 水平，AUC值高达0.920，较商用抗PT-IgG ELISA 试剂盒诊断准确性更高。de Greeff 等[32]使用ELISA 法确定双血清和单血清中IgG-PT 的特异性和最佳阈值，结果发现单血清的AUC 值为0.993，特异度为0.957，而双血清的AUC值为0.999，特异度为0.992，但由于采集不同时间点的双份血清比较难，因此单份血清诊断在实际工作中的操作性更强。另外有研究表明，百日咳IgG 血清阳性率和几何平均浓度水平受年龄和免疫史的影响显著[33]。目前欧盟建议用ELISA 法检测出PT 特异性IgG抗体浓度以IU/ml 为单位，以WHO 内参血清作为阳性对照。ELISA 法检测诊断百日咳基层普及率高，操作简单，检测时间短，结果准确，但实际应用时需要发病数周才能进行诊断。此外，1 年内疫苗接种史和感染史所呈现的假阳性也容易造成诊断困难，并且各实验室间的检测标准缺乏统一。

2.3.2 IgM、IgA 和IgG 抗体诊断 有研究表明IgM、IgA和IgG 偏低是诱发百日咳病情加重的独立危险因素[34]，初次感染百日咳的患儿在第2 周会产生IgM、IgA和IgG 抗体，IgM 抗体会持续2～3 个月，而IgA 抗体则持续4～6 个月，IgG 抗体则在6～8 周后达到峰值浓度，直到成年以后仍可被检测到[35]。史海燕[36]对100 例百日咳疑似病例实行IgM 和IgG 检测，结果发现IgG 抗体检测的阳性率高于IgM 抗体。张玥等[37]检测了406 份百日咳患儿的抗体指标，亦发现PT-IgG 抗体检测的阳性率（12%）高于PT-IgM（7%）。此外，百日咳杆菌核酸（bordetella pertussis-DNA，BP-DNA）检测与PT-IgG 有显著差异，与PT-IgM 检测无差异。因此，在诊断百日咳时，最好结合BP-DNA 检测结果和百日咳抗体检测指标，可使诊疗结果更为可靠。但事实上血清学抗体检测方法存在不同，而各实验室间的分析差异往往导致结果相差较大。如刘倩等[38]对669 例百日咳疑似病例进行百日咳PT-IgG 抗体和IgM 抗体检测，结果发现IgM 抗体的阳性率为37.52%，显著高于PT-IgG 阳性率（20.47%），推断IgM 抗体对百日咳的临床诊断具有辅助价值；Knuutila 等[39]利用多重横向流动免疫分析法检测PT、PRN 和FHA 抗体，结果发现IgA 和IgM 对急性感染患儿的特异度比IgG 更高。总的来说，抗体血清学诊断的血液标本更易获取且标本质量有保证，操作简单快捷，更易于基层实验室展开筛查诊断工作，但抗原进入后需经过一定的潜伏期才会产生IgM 和IgG，因此在诊断早期百日咳时，抗体检测还存在一定时间限制。

2.3.3 PT、FHA、PRN 和Fim 抗原诊断 PT、FHA 和PRN 抗原是指诱导机体发生百日咳免疫应答的物质，可被T/B 淋巴细胞表面的抗原受体特异性识别和结合。卫辰等[40]使用ELISA 法检测血清学指标时发现，不同来源的PT、FHA 和PRN 抗原检测的IgG 抗体结果具有显著性差异，不具备直接可比性。有研究表明Fim 也可以诊断百日咳。杨柏峰等[41]通过荧光-ELISA法检测Fim2/3 和PT 中的抗体，结果发现Fim3 的抗体诊断百日咳阳性率高于PT，由此认为Fim2/3 中抗体的检测是一种敏感的血清学诊断百日咳的方法。另外，Rajam 等[42]开发了一种基于微球的多重抗体捕获技术，可以同时定量PT、PRN、FHA、Fim 2 和Fim 3 等5 种抗原的特异性抗体，在百日咳诊断上具有较好的应用前景。但PT、FHA、PRN 和Fim 抗原诊断对实验室条件及操作规范的要求较高，不利于基层医院开展。

2.4 核酸检测 目前常用PCR 法检测百日咳病原体的核酸，WHO 和美国疾病预防控制中心已将PCR 法列为百日咳实验室确诊方法之一。核酸检测的PCR法包括传统PCR、实时荧光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）和多重PCR。

2.4.1 传统PCR 传统PCR 只有1 对引物，主要用于单一致病因子的鉴定。由于PCR 不需要采集活菌即可获得阳性结果，因此比细菌培养更敏感[43]。然而，传统PCR 需要进行预处理，易造成实验交叉污染，检测准确率不高，因此，已逐渐被qRT-PCR 取代。

2.4.2 qRT-PCR qRT-PCR 已成为国际诊断百日咳的首选方法。李玥等[27]采用qRT-PCR 方式检测864 例百日咳患儿的鼻咽拭子标本，检出百日咳阳性样本数399 例，占送检患儿总数的46.2%，检测灵敏度（51.5%）高于细菌培养（27.1%）。刘倩等[44]采用qRT-PCR 检测出百日咳阳性病例94 例，并发现病程＜14 d 的百日咳疑似病例检测阳性率最高。此外，汪丙松等[45]发现传统PCR 检测出的阳性率与咳嗽时间显著相关，因此传统PCR 检测应在病程早期进行。随着咳嗽病程的延长，传统PCR 检测阳性率逐渐降低。王青等[46]将qRTPCR 和常规细菌培养进行比较分析，发现qRT-PCR 法检测核酸具有更高的灵敏度和特异度。综上所述，qRT-PCR 方法灵敏度和特异度高，检测迅速，但该技术要求严格，成本高，在基层医院难以开展。

2.4.3 多重PCR 多重PCR 中，反应体系加入两对及以上的引物，可同时扩增出多个核酸片段，因此可用于多种病原微生物的同时检测。Tao 等[47]利用FilmArray 多重PCR 技术在140 名疑似百日咳患儿中检测到35.0%的百日咳鲍特杆菌，32.9%的鼻/肠道病毒和31.4%的呼吸道合胞病毒，表明该方法为百日咳感染患者提供合并感染信息，具有潜在的临床意义。Martini 等[48]认为以IS481、IS1001、IS1002 和recA 为靶点的多重PCR 可筛选及鉴别百日咳鲍特杆菌与其他鲍特菌属，表明增加多个靶点可以提高PCR 的灵敏度和特异度，从而更好地区分不同的鲍特菌属。此外，多重PCR 对患者样本的培养也有一定的指导意义。Gao等[49]利用插入IS481 序列IS1001、IS1002 和ptxS1 建立多靶点实时PCR，结果发现其敏感度和特异度分别为77%和88%，所有IS481Ct＜30 的患者检测为阳性，IS481Ct≥40 的患者均为阴性，因此建议对IS481Ct值为30～40 的标本进行培养。总的来说，多重PCR 的临床灵敏度优于其他PCR 检测，但多引物的使用可能降低检测的灵敏度[12]。

2.5 其他检测方法 直接荧光抗体试验（direct fluorescent antibody，DFA）、环介导等温扩增技术（loopmediated isothermal amplification，LAMP）、颗粒凝集试验和中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞簇集试验也可用于百日咳的实验室检验。鼻咽标本DFA 测定是早期诊断百日咳的一种简单低廉的方法，显微镜可见百日咳杆菌细胞荧光抗体，但因其特异度和灵敏度均较低，还可能与鼻咽中的其他病原体产生交叉反应，目前已不使用该方法[15]。相比qRT-PCR，LAMP 更为简单快速，仅需12～30 min 即可完成检测，其检测灵敏度与特异度分别为92.59%和98.39%[50]。Sun 等[51]评估LAMP-侧向流动生物传感器（lateral flow biosensor，LFB）测定在百日咳杆菌感染临床诊断中的可行性，结果发现LAMP-LFB 和定量PCR（quantitative PCR，qPCR）测定结果的一致性为98%，可靠性高。颗粒凝集试验是诊断百日咳感染的有效方法，该方法血清用量少，操作简单，结果可重复性高，特异度高，便于基层医院的开展，但由于凝集颗粒小，凝集终点界限不明显，判定结果颇为困难[52]，因此已很少使用。百日咳患儿血清中的PT 抗体可以中和PT 的细胞毒性，抑制CHO 细胞簇集现象[53]。在细胞簇集结果的读取上，Bernardo 等[54]通过xCELLigence 实时细胞分析系统量化细胞增殖和黏附作用，减小了操作误差。CHO 细胞簇集实验可以直接评估抗体中和PT 毒性的能力，但该方法需要培养细胞，对实验室条件和操作规范要求较高。

3 小结与展望

在中国，临床医生诊断百日咳仍以临床症状为主，缺乏统一的实验室诊断标准；同时由于典型症状并不明显，临床漏诊和误诊也时常发生。梳理和分析百日咳诊断的实验室检查方法可知，从鼻咽部分泌物中培养分离得到百日咳鲍特杆菌可用于百日咳卡他期的检测，血清学方法检测PT-lgG 抗体可提高痉咳期或恢复期的百日咳诊断效能，而核酸PCR 检测可用于百日咳的各个阶段，弥补了血清学难以诊断早期百日咳的缺点。因此，合理使用实验室检查方法，充分利用各自优势并相互补充，可降低百日咳临床的漏诊、误诊率，及时准确诊断百日咳。