依维莫司联合RSL3 诱导肺腺癌细胞铁死亡的机制研究

刘永洋 焦德敏 刘翔 唐夏莉 陈君 陈清勇

肺癌是癌症患者死亡的常见原因，发病率在全球范围内呈逐年上升趋势[1]。目前肺癌患者的治疗方法包括手术、化疗、放疗、分子靶向治疗、免疫治疗、光动力或激光治疗等[2]，尽管晚期肺癌的治疗已经取得了许多进展，但患者的5 年总生存率仍较低（约19%）[3]。铁死亡是一种铁依赖的、由脂质活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基大量累积、细胞内脂质过氧化物代谢障碍所致的程序性细胞死亡[4]。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）4 通过将过氧化物还原为相应的醇，限制铁依赖的有毒自由基的形成，从而抑制脂质ROS 的生成[5]。（1S, 3R）-2-（2-氯乙酰基）-1-[4-（甲氧羰基）苯基]-2, 3, 4, 9-四氢-1H-吡啶（3, 4-B）吲哚-3-羧酸甲酯（RSL3）最初是在化学筛选中发现的一种铁死亡诱导剂，可共价结合并抑制GPX4 活性导致脂质过氧化物聚集，从而诱导铁死亡[6]。RSL3 可诱导多种肺腺癌细胞发生铁死亡[7-9]，且通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）丝氨酸2 448 位点的磷酸化，进一步降低癌细胞中的GPX4 蛋白水平[10]。但并非所有的肺癌细胞都对RSL3 敏感，联合用药是提高RSL3 疗效的有效途径[11]。依维莫司（everolimus，EVE）是一种选择性的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）抑制剂，药理学研究发现抑制mTORC1 可使癌细胞对GPX4 抑制诱导的铁死亡敏感[12]。提示EVE 可能提高RSL3 诱导肺腺癌细胞铁死亡的能力，两者联合治疗肺腺癌可能是一种有前景的治疗策略。本研究探讨EVE 联用RSL3 诱导肺腺癌细胞铁死亡的作用及机制，为临床治疗肺腺癌提供新的实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞 人肺腺癌细胞系PC9 和H1299 购自中国科学院上海细胞库，培养于含10% FBS 的RPMI 1640培养基中，添加100 U/ml 青霉素和100 mg/L 链霉素。所有细胞在37 ℃、5%二氧化碳（CO2）的湿化细胞孵育箱中培养，根据细胞生长情况每2～3 d 正常传代。

1.2 主要试剂 FBS（批号：2437694）购自美国Gibco公司；RPMI 1640（批号：2022102404）培养基购自南京森瑞生物；噻唑蓝溴化四唑（thiazolyl blue bromide tetrazolium，MTT）（批号：E26688D183）购自武汉博士德生物公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批号：22102134）购自广州Biosharp 公司；RIPA 裂解液（批号：061919191015）、WB/IP 裂解液（批号：080922220930）、增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（批号：22041739）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（批号：050222220908）购自上海碧云天公司；酶抑制剂cOmplete Mini（批号：41410100）购自德国Roche 公司；铁比色分析试剂盒（批号：32564-32569）购自美国ScienCell公司；铁抑制素1（ferrostatin-1，Fer-1）（批号：120086）、RSL3（批号：122224）购自美国MCE 公司；EVE（批号：M1709-12）购自美国Abmole 公司；GPX4 抗体（批号：GR3438547-3）购自美国Abcam 公司；磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylatemammalian target of rapamycin，p-mTOR）（批号：7）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批号：GR194633-9）抗体购自美国CST 公司。

1.3 方法

1.3.1 各组细胞存活率检测 采用MTT 法。将对数生长期的PC9 和H1299 接种于96 孔板，调整细胞密度为5×103/孔，培养24 h。两种细胞分别分对照组（药物浓度为0），不同浓度（2.5、5.0、10.0 μmol/L）EVE 组，不同浓度（H1299 使用0.125、0.250、0.500、1.000 μmol/L浓度；PC9 使用1.000、2.000、4.000、8.000 μmol/L 浓度）RSL3 组，RSL3+EVE 组（上述不同浓度RSL3 加10.0 μmol/L EVE）。在检测Fer-1 效果时，在上述各组处理基础上加2 μmol/L Fer-1，每组重复5 次，并设置对照孔、调零孔。继续培养24 h，弃去旧培养基，加入20 μl/孔5 g/L 的MTT，继续培养4 h，弃MTT，加入DMSO 150 μl/孔，振荡10 min，待蓝紫色结晶物完全溶解后，用酶标仪测定490 nm 处的吸光度。使用相差显微镜观察细胞生长情况，计算细胞存活率。

1.3.2 各组细胞内亚铁离子（Fe2+）相对水平检测 根据铁比色分析试剂盒说明书配制不同浓度铁标准品、还原试剂及反应工作试剂。H1299 分别用10.0 μmol/L EVE（EVE组）、1.000 μmol/L RSL3（RSL3组）、10.0 μmol/L EVE+1.000 μmol/L RSL3（EVE+RSL3 组）处理，PC9 分别用10.0 μmol/L EVE（EVE 组）、8.000 μmol/L RSL3（RSL3 组）、10.0 μmol/L EVE+8.000 μmol/L RSL3（EVE+RSL3 组）处理，以不作处理的细胞为对照组。12 h 后收集细胞并与铁检测缓冲液按体积比1∶4 在冰上混合匀浆裂解，4 ℃、11 600 r/min 离心10 min，收集上清液；将缓冲液、还原剂、样本反应剂按93∶2∶5 的体积比配制铁检测试剂，再将上清液样品与等体积的还原剂混合后11 600 r/min 离心5 min，留取上清液作为待测样本。在96 微孔板中加入50 μl 上述不同浓度的标准品和待测样本（均设两组复孔），加入200 μl/孔的铁反应工作试剂，25 ℃暗室内孵育30 min 后，用酶标仪测定590 nm 处的吸光度，绘制标准曲线，计算各待测样本中的Fe2+相对水平。

1.3.3 各组细胞中MDA 相对水平检测 MDA 是细胞脂质过氧化后分解的产物，可间接反映脂质过氧化水平。取H1299 和PC9，参照1.3.2 分组。培养12 h 后收集细胞，根据MDA 检测试剂盒方法用WB/IP 裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、11 200 r/min 离心10 min，取上清液作为待测样本。根据BCA 蛋白浓度检测方法检测样本总蛋白浓度；分别取待测样本及标准品，加入MDA 检测工作液，混匀后100 ℃金属浴加热15 min，水浴冷却至室温，3 200 r/min 离心10 min；取上清液，酶标仪测定532 nm 处的吸光度。根据标准品组所得标准曲线计算待测样本中的MDA 相对水平。

1.3.4 各组细胞内mTOR/GPX4 通路相关蛋白表达的检测 采用Western blot 法。取H1299 和PC9 接种于6孔板，参照1.3.2 分组。培养24 h 后每孔加适量细胞裂解液及酶抑制剂，冰上裂解30 min，提取总蛋白，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清液作为待测样本。根据BCA 蛋白定量计算样品蛋白浓度，根据样品蛋白浓度用裂解液调整各组总蛋白量，加入1/5 体积的上样缓冲液后，100 ℃金属浴10 min 使蛋白变性，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白、电转膜、三羟甲基氨基甲烷吐温缓冲液（Tris buffer solution+Tween，TBST）+5% FBS 封闭液封闭1 h，聚偏氟乙烯膜条带分别加入p-mTOR、GPX4 一抗，4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤3 次，10 min/次，加入相应二抗室温孵育1 h，TBST 再次洗涤后，加入ECL 显影液在暗室内曝光显影。使用Image J 软件计算各个条带的灰度值，以GAPDH 为内参，计算p-mTOR、GPX4 蛋白相对表达量。

1.4 统计学处理 使用GraphPad Prism 8 和SPSS 26统计软件测定数据并画图。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。双侧检验P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞存活率的比较 与对照组比较，不同浓度EVE 组细胞存活率无显著变化，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图1A（插页）。与RSL3 组比较，EVE+RSL3 组细胞存活率均显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图1B（插页）。与未加Fer-1 的RSL3 组、RSL3+EVE 组比较，加入Fer-1 后的RSL3 组和RSL3+EVE 组细胞存活率显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图1C-F（插页）。

图1 各组细胞存活率的比较（A：不同浓度EVE 处理下，细胞存活率比较；B：RSL3 联合EVE 处理，细胞存活率比较；C：Fer-1 干预下，各组H1299 细胞存活率比较；D：相差显微镜观察各组H1299 细胞生长情况，×40；E：Fer-1 干预下，各组PC9 细胞存活率比较；F：相差显微镜观察各组PC9 细胞生长情况，×40）

2.2 各组细胞内Fe2+、MDA 相对水平比较 相比其他组，EVE+RSL3 组H1299 和PC9 细胞内Fe2+和MDA 相对水平均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2。

图2 各组细胞内Fe2+、MDA 相对水平比较（A：不同处理下，H1299 和PC9 细胞内Fe2+相对水平比较；B：不同处理下，H1299 和PC9细胞内MDA 相对水平比较）

2.3 各组细胞内p-mTOR、GPX4 蛋白表达的比较 相比对照组，EVE 组、RSL3 组及EVE+RSL3 组细胞内pmTOR 蛋白相对表达量均显著降低（均P＜0.01），其中EVE+RSL3 组p-mTOR 蛋白相对表达量均最低，见图3A-B。相比对照组，EVE 组、RSL3 组和EVE+RSL3 组细胞内GPX4 蛋白表达水平均显著降低（均P＜0.05），其中，EVE+RSL3 组GPX4 蛋白表达水平均最低，见图3C-D。

3 讨论

铁死亡是一种在发生机制上与细胞凋亡显著不同的程序性细胞死亡，大量研究已经报道RSL3 能够诱导肿瘤细胞铁死亡[13]，但并非所有细胞对RSL3 敏感，可能与细胞内GPX4 表达量及肿瘤类型有关[5]。不同肺腺癌细胞对RSL3 的敏感性差别较大，中位抑制浓度值从几百nmol 到几十μmol 不等，磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称Akt）/mTORC1 通路激活的癌细胞不易被RSL3 诱导发生铁死亡，而抑制PI3K/Akt/mTORC1 通路后可恢复癌细胞对铁死亡的敏感性[10]。EVE 作为一种mTORC1 抑制剂，单药治疗肺癌时效果甚微，但联合用药能够提高其在肺癌中的疗效及限制药物不良反应[14-16]。在本研究中，不同浓度EVE 对H1299 及PC9 细胞增殖无影响，EVE 联合RSL3 处理后细胞存活率较单用RSL3 显著降低，使用铁抑制素后，EVE 联合RSL3 处理导致的细胞活力下降被显著逆转，相比RLS3 单独处理，EVE联合RSL3 处理后的细胞内Fe2+及MDA 相对水平升高程度十分明显。表明EVE 联合RSL3 可通过诱导铁死亡发挥协同抗肿瘤作用。

GPX4-谷胱甘肽（glutathione，GSH）抗氧化系统是细胞内最主要的铁死亡防御系统，GPX4 可将过氧化物还原为相应的醇，从而限制铁依赖的有毒自由基，抑制脂质ROS 的生成[17]。因此，抑制GPX4 的活性及促进GPX4 的降解均有可能增强肿瘤细胞铁死亡，Gaschler 等[18]报道1,2-二氧戊环（FINO2）可通过GPX4失活和铁氧化引发铁死亡，小白菊内酯衍生物DMOCPTL 主要通过促进GPX4 的泛素化降解诱导三阴性乳腺癌细胞铁死亡[19]，蟾蜍他灵通过促进GPX4 的泛素化并降解诱导非小细胞肺癌细胞铁死亡[20]。而PI3K/Akt/mTORC1 通路活化可增强下游真核翻译起始因子4E 结合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）的合成，4EBP1 进一步与GPX4 的启动子结合促进其转录翻译。因此，抑制mTORC1 可导致GPX4 蛋白表达水平下调[11]。EVE 是有效的mTORC1 抑制剂，本研究中，EVE 可抑制两种肺腺癌细胞内p-mTOR 蛋白表达，亦可抑制H1299 细胞内GPX4 蛋白表达，RSL3 可抑制两种细胞内p-mTOR及GPX4 蛋白表达，两者联合处理后细胞内p-mTOR及GPX4 蛋白表达进一步降低，提示EVE 可能通过mTOR/GPX4 途径增强RSL3 诱导肺腺癌细胞铁死亡。综上所述，本研究认为EVE 可增强RSL3 作用，诱导肺腺癌细胞铁死亡，其机制可能与抑制mTOR/GPX4通路有关。本研究可能为通过诱导铁死亡治疗肺腺癌提供新的见解。