低氧环境下甲状腺乳头状癌细胞中期因子表达的调节机制研究

李吉 张建辉 谢中意 李君强

在中国，甲状腺癌确诊患者每年新增约20%。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的甲状腺癌类型，占所有甲状腺癌病例的75%～85%[1]，多发于女性，好发于20～55 岁年龄段。多数PTC进展缓慢，患者预后良好，但仍有少数患者出现淋巴结转移甚至血道传播[2]。某些特定基因如鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1 V600E 突变[3]、缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）1-α 的异常激活等，可诱导PTC 发生且导致患者预后恶化[4]，因此明确肿瘤相关基因及其作用机制可为PTC 诊疗、预后评估提供有价值的信息。研究发现，HIF1-α 不仅能够诱导ABC转运蛋白等蛋白将化疗药物排出细胞，介导产生耐药性[5]，且能够激活CD10、半乳糖凝集素3（galectin-3，gal3）等效应分子，进一步调节PTC 细胞系的增殖和能量代谢途径等[5-6]。低氧环境下肿瘤细胞能够分泌各种细胞因子，其中中期因子（Midkine）可诱发肿瘤微环境中的免疫抑制信号，增强癌细胞的血管生成和增殖活性[7]，但具体调节机制仍有待明确。本研究旨在探讨低氧环境下PTC 细胞中CD10、gal3 等蛋白的表达情况和相应的分子生物学意义，阐述其对Midkine 表达的调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及培养条件 人PTC 细胞系BCPAP 与TPC1 购于国家实验细胞资源共享服务平台，接种至含10%FBS 的DMEM 培养基。正常培养条件为37 ℃、5%氧气（O2）、5%二氧化碳（CO2）。缺氧培养条件为37 ℃、1%O2、5%CO2。

1.1.2 主要试剂 lipofectamine 2000 转染试剂盒（批号：11668030）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（批号：23225）购自美国ThermoFisher公司；HIF1-α、CD10、gal3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（批号分别为ab179483、ab256494、ab209344 和ab9485）均购自美国abcam 公司；兔抗辣根过氧化物酶、鼠抗辣根过氧化物酶（批号为A0208 和A0216）购自上海碧云天生物技术有限公司；双荧光素报告酶试剂盒（批号：E1910）购自美国Promega 公司；ELISA 检测试剂盒（批号：EH319RB）购自美国invitrogen 公司。HIF1-α小发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列为5'-GAAACTCTTCCAAGCAATTTT-3'、CD-10 的编码基因膜金属肽内切酶（membrane metalloendopeptidase endonuclide，MME）shRNA 序列为5'- CTAAGGTCTATCAAGTCAATC-3'、gal3 的编码基因人可溶性半乳糖凝集素3（lectin galactoside binding soluble-3，LGALS3）shRNA 序列为5'-TGCCTCGCATGCTGATAACAA-3'，均由美国sigma 公司合成；HIF1-α cDNA、CD10 cDNA、gal3 cDNA、CD10 启动子、gal3 启动子均由华大基因公司合成。二甲基乙二酰氨基乙酸（dimethyloxallyl glycine，DMOG）购自美国selleckchem 公司，批号：S7483。二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自美国sigma 公司，批号：67-68-5。

1.2 方法

1.2.1 不同培养条件下细胞HIF1-α、CD10 与gal3 蛋白表达的检测 采用Western blot 法。取BCPAP 和TPC1 分为常氧组与缺氧组，常氧组正常培养，缺氧组缺氧培养。两组细胞均培养24 h 后使用RIPA 裂解液冰上裂解30 min，根据BCA 蛋白定量试剂盒方法检测总蛋白；将蛋白转至PVDF 膜上，并使用5% BSA 室温封闭1 h，4 ℃过夜；标记相应的一抗，抗体稀释比例均为1∶1 000；室温孵育30 min 后标记相应的二抗，稀释比例为1∶5 000；使用ECL 发光液检测蛋白灰度值。以GAPDH 为对照，检测细胞中HIF1-α、CD10、gal3 蛋白相对表达量。

1.2.2 DMOG 对缺氧组细胞HIF1-α、CD10 与gal3 表达的影响 取缺氧培养的BCPAP 和TPC1 分为DMOG 组和对照组，DMOG 组加入5 μl/孔1 mmol/L DMOG，对照组每孔使用等体积DMSO，培养24 h。参照1.2.1 采用Western blot 法计算两组细胞HIF1-α、CD10、gal3 蛋白相对表达量。

1.2.3 不同缺氧时间下细胞HIF1-α、CD10 与gal3 蛋白表达的检测 BCPAP 和TPC1 细胞分别在低氧环境下培养0、2、4、6、12 与24 h。取出细胞，参照1.2.1 采用Western blot 法计算各组HIF1-α、CD10、gal3 蛋白相对表达量。

1.2.4 转染HIF1-α shRNA 对CD10 与gal3 蛋白表达的影响 取正常培养的BCPAP 和TPC1，各分为实验组和对照组，实验组转染HIF1-α shRNA，对照组转染HIF1-α shRNA 的乱码序列，培养48 h。参照1.2.1 采用Western blot 法检测各组细胞中HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白相对表达量。

1.2.5 HIF1-α 与CD10、gal3 靶向性预测及验证 取正常培养的BCPAP 和TPC1 细胞各分为4 组。MME 沉默实验中，空白组转染不含启动子序列的空载质粒，对照组转染携CD10 启动子质粒，HIF1-α 组共转染携CD10 启动子和HIF1-α cDNA 质粒，实验组共转染携CD10 启动子和CD10 cDNA 质粒。LAGLS3 沉默实验中，空白组转染不含启动子序列的空载质粒，对照组转染携gal3 启动子质粒，HIF1-α 组共转染携gal3启动子和HIF1-α cDNA 质粒，实验组共转染携gal3启动子和gal3 cDNA 质粒。各组细胞均培养48 h。采用双荧光素报告酶法。取各组细胞用PBS 清洗2 次，加入裂解缓冲液常温摇床震荡裂解15 min；依次加入加入荧光素报告酶反应液Ⅱ和stop&glo 液，测定各质粒荧光值，进行HIF1-α 与CD10、gal3 的靶向性验证。

1.2.6 基因相关性分析 使用GEOmetadb 包完成GEO数据库的检索，确定备选数据集为GSE60542（n=92），使用GEOquery 包下载该数据集，经log2 转换进行标准化处理；使用cor.test（）函数计算HIF1-α 和MME、LGALS3 之间的Pearson 相关系数，并使用plot（）函数绘制散点图。

1.2.7 转染细胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表达的检测 取正常培养的BCPAP 和TPC1 各分为4 组，对照组转染空载体，MME 敲低组转染携MME shRNA 质粒，LGALS3 敲低组转染携LGALS3 shRNA 质粒，实验组共转染MME shRNA 和LGALS3 shRNA 质粒，低氧条件下培养48 h。采用Western blot 法检测各组细胞中HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白相对表达量。

1.2.8 不同缺氧时间和转染细胞Midkine 表达的检测 采用ELISA 法。BCPAP 和TPC1 细胞分别在低氧环境下培养0、2、4、6、12 与24 h。1.2.7 中各组细胞培养48 h。取细胞上清液500 μl，4℃、6 000 r/min 离心5～10 min ，取上清液。参照ELISA 检测试剂盒说明书方法，使用酶标仪检测450 nm 下的吸光度。根据标准曲线计算上清液Midkine 水平。

1.3 统计学处理 使用R（4.0.5）统计软件。计量资料两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。使用Pearson 相关分析计算基因间的关联性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同培养条件下细胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表达的比较 相比常氧组，缺氧组细胞HIF1-α、CD10与gal3 蛋白相对表达量均显著上升，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图1A。相比对照组，DMOG 组HIF1-α、CD10 与gal3 蛋白表达水平也显著上升，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图1B。

图1 不同培养条件下细胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表达的比较（A：缺氧对蛋白表达的影响；B：DMOG 对蛋白表达的影响）

2.2 不同缺氧时间下细胞HIF1-α、CD10 与gal3 蛋白表达的变化 细胞中HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表达总量呈现时间依赖性，均随着低氧诱导时间增加而增加，见图2。

图2 不同缺氧时间下细胞HIF1-α、CD10与gal3蛋白表达总量的变化（A：BCPAP；B：TPC1）

2.3 转染HIF1-α shRNA 细胞CD10 和gal3 蛋白表达的比较 相比对照组，实验组细胞中CD10 和gal3 蛋白相对表达量均显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图3。

图3 转染HIF1-α shRNA 细胞CD10 与gal3 蛋白表达的比较（A：蛋白电泳图；B：CD10、gal3 蛋白表达的比较）

2.4 HIF1-α 与CD10、gal3 的靶向性检测 相比空白组，其他各组荧光素酶相对活性均显著提高（均P＜0.01）；提示HIF1-α cDNA 可通过直接与CD10 和gal3启动子结合增强两者的转录表达，见图4。

图4 HIF1-α 与CD10、gal3 的靶向性检测（A：BCPAP；B：TPC1）

2.5 HIF1-α 与MME、LGALS3 mRNA 的相关性分析在mRNA 水平上可观察到HIF1-α 与MME 和LGALS3表达的相关系数分别为0.43 和0.58，均呈正相关（均P＜0.01），见图5。

图5 基因相关性分析（A：HIF1-α 与LGALS3 mRNA 表达的相关性；B：HIF1-α 与MME mRNA 表达的相关性）

2.6 转染细胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表达的比较 相比对照组，MME 敲低组CD10 蛋白相对表达量显著下降，LGALS3 敲低组gal3 蛋白相对表达量显著下降，实验组CD10 和gal3 蛋白相对表达量均显著下降，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图6。

图6 转染细胞HIF1-α、CD10 和gal3 蛋白表达的比较（A：BCPAP 蛋白电泳图；B：各组BCPAP 中蛋白表达的比较；C：TPC1 蛋白电泳图；D：各组TPC1 中蛋白表达的比较）

2.7 不同缺氧时间和转染细胞Midkine 表达的比较随缺氧时间延长，细胞中Midkine 表达水平升高，见图7A。低氧培养48 h 后，MME 敲低组、LGALS3 敲低组细胞中Midkine 表达水平相比对照组显著降低，实验组Midkine 表达水平进一步下降，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图7B。

图7 不同缺氧时间和转染细胞中Midkine 表达水平的比较（A：不同缺氧时间下细胞Midkine 表达水平；B；不同转染细胞Midkine表达水平）

3 讨论

临床发现绝大多数实体肿瘤呈现缺氧微环境，在实体肿瘤中，缺氧环境主要表现为脉管系统70～150 μm范围内O2由于肿瘤增殖而被快速消耗，因此肿瘤组织中的缺氧与内部异常的血管增生、肿瘤细胞对O2需求的大幅增加高度相关[8]。缺氧带来的影响主要为糖酵解途径的改变，包括HIF1-α、葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter-1，GLUT-1）、磷酸葡萄糖异构酶表达、磷酸甘油酸激酶1 等糖酵解途径酶表达的异常，从而诱导肿瘤细胞出现高糖酵解率，在这一过程中HIF1-α发挥着至关重要的作用。HIF1-α 广泛参与PTC 中的多条关键信号通路，如通过诱导血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）促进血管生成[9]，通过GLUT-1 介导肿瘤细胞的厌氧代谢[10]，通过碳酸酐酶IX（Carbonic anhydrase IX，CA-9）调节细胞内pH[11]，通过p21、p27 等蛋白调节细胞周期[12]。近年来，HIF1-α 对细胞外基质的重塑以及对细胞迁移能力的调节日趋成为研究热点，低氧环境下肿瘤细胞能够通过调节特定蛋白如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、MMP-9 的表达[13]，或是特定细胞因子如Midkine 的表达来激活免疫抑制信号，阻断免疫微环境中CD8+、M1 巨噬细胞等效应性免疫细胞的浸润，进而诱发“冷肿瘤”的形成，严重削弱抑癌药物作用[14]。因此明确低氧环境下肿瘤细胞的关键效应分子，对寻找肿瘤发生、发展过程的潜在诊疗靶点十分必要。

DMOG 是具有细胞渗透和竞争性的脯氨酰羟化酶抑制剂，可导致HIF1-α 的积聚和稳定，本研究使用缺氧与DMOG 模拟缺氧相结合培养细胞，结果发现BCPAP 与TPC1 细胞系受DMOG 刺激后，gal3、CD10 的表达均显著上升，且对低氧环境呈现时间依赖性。在PTC 患者中，gal3 与Midkine 表达相关，且与患者预后、肿瘤转移密切相关[15]。Midkine 是一种肝素结合生长因子，最初由于在小鼠胚胎发生过程中高度表达而受到关注[16]，作为一种在肿瘤中大幅上升的可溶性分泌蛋白，Midkine 不仅可通过肉瘤家族基因（sarcoma family of genes，Src）/有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）/ 磷脂肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路影响肿瘤细胞的增殖，缺氧状态下，Midkine 还可与HIF1-α 结合介导缺氧状态下的血管生成[17-18]。已有报道表明CD10广泛参与免疫抑制因子如IL-6、IL-8 的分泌[19-20]，在大多数恶性肿瘤中CD10 表达上调，且与肿瘤分期呈现正相关[21]，肿瘤微环境中的缺氧条件被认为是CD10表达上调的关键原因之一[22]。gal3 是一种结构独特的糖蛋白，广泛参与纤维化、炎症、癌症等多种疾病背景，在细胞表面的免疫突触中结合T 细胞抗原受体，抑制T 细胞的早期激活[23-24]，而在细胞内gal3 可通过结合B 细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）结合抑制细胞凋亡[25]，但尚无相关研究证实CD10 与Midkine 之间的关联。本研究双荧光素报告酶实验证实HIF1-α 可结合到CD10 与gal3 的启动子上，并直接调节CD10 与gal3 的转录水平，检测CD10、gal3敲低细胞系中Midkine 表达量变化可知，随着CD10、gal3 的表达沉默，Midkine 的表达亦显著下降，表明CD10、gal3 可在低氧环境下，诱导PTC 细胞系中Midkine 的表达。即在低氧环境中，HIF1-α 可通过直接调控CD10、gal3 表达进而调节Midkine 的表达[26]。但小分子抑制剂或抗体阻断HIF1-α 诱导的CD10、gal3的表达，及Midkine 的表达抑制以及相应的细胞功能变化等，还有待进一步研究。

综上所述，本研究发现HIF1-α 可通过调控CD10、gal3 影响Midkine 表达，为进一步的诊疗靶点开发构筑了生物学基础。