健脾填精方对血管性痴呆小鼠脑组织蛋白的影响

龚娟芬 刘吉丹 房梦园 苏蒙 李伟光 何迎春

血管性痴呆（vascular dementia，VD）指因各种脑血管损伤导致学习、记忆、计算能力、定向力等认知功能严重下降的临床综合征[1]。现用于改善VD 症状的药物主要是多奈哌齐、加兰他敏和美金刚等[2]，这些药物疗效有限，还可能引起严重的不良反应，如呕吐、腹泻、头痛和高血压等[3]。相比于单靶点化学药物，中药具有多组分、多靶点、不良反应少等特点，在VD 的治疗中发挥了积极的作用[4-5]。健脾填精方由人参、天麻、白术、巴戟天、石菖蒲、黄连、菟丝子等中草药组成，能改善轻度认知功能障碍患者的学习记忆功能，提高患者生活质量[6]。动物研究发现，健脾填精方治疗VD 的机制可能与减少大鼠脑组织氧化应激损伤，维持海马的线粒体膜电位和ATP 水平，改善线粒体功能障碍等相关[7]。中药复方成分复杂，定量蛋白质组学技术是寻找疾病生物标志物和药物治疗靶点的新型手段[8]，能从分子层面分析中药复方的作用机制。本研究通过蛋白质组学技术筛选健脾填精方干预VD小鼠脑组织差异表达蛋白，并进一步对差异蛋白进行生物信息学分析，以期为健脾填精方的临床应用及药物药理研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物 ICR 雄性小鼠40 只（无特定病原体，6～8 周龄，体质量18～22 g），由上海市计划生育研究所动物经营部提供，动物合格证编号SCXK（沪）2018-0006，在浙江中医药大学动物实验研究中心饲养，实验动物使用许可证号SYXK（浙）2021-0012。所有小鼠提前适应性喂养1 周，实验房室温为（22±2）℃，湿度为（63±2）%，光照为明/暗=12 h/12 h，噪音＜55 dB，自由进食和饮水。所有程序均按照浙江中医药大学动物实验中心指南进行，并由浙江中医药大学动物伦理委员会批准，批准编号IACUC-20210906-12。

1.2 实验药物 自拟健脾填精方：人参9 g，天麻9 g，白术10 g，巴戟天6 g，石菖蒲6 g，黄连3 g，菟丝子12 g，由浙江中医药大学中药教研室鉴定。前期研究发现健脾填精方最佳剂量为14.4 g/（kg·d），按照人与动物间体表面积折算的等效剂量比值换算成小鼠的治疗剂量为20.160 g/（kg·d），口服剂量为10 mg/（kg·d）[9]。本研究中健脾填精方颗粒剂（含有草药55g）用约27.3 ml 0.9%氯化钠溶液溶解，得到终浓度为2.016 g/ml的健脾填精方溶液。

1.3 主要试剂 二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白质定量试剂盒（批号：P0012）和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（批号：P0015F）购自上海碧云天生物技术有限公司；碘乙酰胺购自美国Sigma 公司，批号：I1149-5G；甲酸（批号：A117）购自德国Thermo Fisher Scientific 公司；乙腈（批号：1000304008）购自上海麦克林生化科技股份有限公司；C18 分析柱（批号：WAT023590）购自美国Waters 公司。

1.4 方法

1.4.1 动物分组、造模及给药 40 只小鼠用随机数字表法分为中药组15 只，模型组15 只，假手术组10 只。所有小鼠均用0.3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，中药组和模型组小鼠采用短暂双侧颈总动脉阻断法建立VD 模型[10]，经颈正中切口显露双侧颈总动脉，用丝线结扎双侧颈动脉10 min，然后松开10 min，重复3次，最后取下丝线缝合伤口。假手术组小鼠仅切开皮肤，不结扎双侧颈总动脉。术后连续3 d 予肌肉注射青霉素5 000 U/d 预防感染，用碘伏消毒伤口直至愈合。术后第7 天开始给药，中药组给予10 ml/（kg·d）健脾填精方溶液灌胃，模型组和假手术组给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃。3 组小鼠均给药28 d。

1.4.2 Morris 水迷宫试验 圆形逃生平台位于第Ⅲ象限。3 组小鼠均训练4 d，将小鼠放置在不同象限内自由游泳90 s，如果90 s 内没有到达安全平台，则引导至平台停留10 s。将小鼠从第Ⅲ象限以外象限的水池壁放入水中，记录到达逃生平台的时间，即逃避潜伏期，共持续测试5 d。撤去圆形逃生平台，将小鼠从第Ⅰ象限的水池壁放入水中，记录1 min 内跨越第Ⅲ象限平台次数和在第Ⅲ象限停留的时间。

1.4.3 3 组小鼠脑组织蛋白提取及肽段制备 Morris水迷宫试验结束后，将各组小鼠迅速断颈处死，快速取脑。每组随机选择3 个脑组织样本加入适量裂解液，超声破碎，沸水浴10 min，14 000 r/min 离心15 min，留取上清液。采用BCA 法测定蛋白浓度[11]。取200 μg蛋白质溶液根据过滤辅助样品制备程序进行酶解，酶解后的肽段采用C18 柱脱盐，肽段冻干后加入40 μl 0.1%甲酸溶液，进行肽段定量。

1.4.4 蛋白质质谱分析 采用NanoElute 系统进行色谱分离。缓冲液A 液为0.1%甲酸水溶液，B 液为0.1%甲酸乙腈水溶液。色谱柱以100%的A液平衡，样品由自动进样器上样到分析柱（IonOpticks，澳大利亚，25 cm×75 μm，C18 填料1.6 μm）分离，流速300 nl/min，持续90 min。进行液相梯度分离：0～75 min，B 液线性梯度为2%～22%；75～80 min，B 液线性梯度为22%～37%；80～85 min，B 液线性梯度为37%～80%；85～90 min，B 液为80%。经色谱分离后的样品用TimsTOF Pro 质谱仪的平行累积连续碎裂技术模式进行质谱分析。

1.4.5 蛋白质鉴定和质谱数据分析 收集TimsTof pro高分辨率质谱仪质谱数据，肽段离子得分＞60 分表示结果可信。7～20 个氨基酸长度的肽段被认为符合胰蛋白酶解和高能碎裂的规律。大部分蛋白对应两个以上肽段，表示蛋白质定量结果可信。将原始质谱数据导入Maxquant 软件（版本号1.6.17.0），采用非标记定量（label free quantitation，LFQ）算法[12]对蛋白质组学数据进行计算，以差异倍数＞1.200 或＜0.833、P＜0.05的标准筛选差异蛋白。

1.4.6 蛋白质生物信息学分析 通过http://www.bioinformatics.com.cn/在线软件对差异表达蛋白进行聚类分析。运用http://geneontology.org/进行基因本体论（gene ontology，GO）分析。通过http://www.kegg.jp/进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。运用STRING 数据库（https:// string-db.org/）构建蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）。

1.5 统计学处理 采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料以表示，采用Levene 法进行方差齐性检验，方差齐时组间比较采用单因素方差分析，方差不齐采用Mann-WhitneyU检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况及Morris 水迷宫试验结果 手术时，中药组和模型组各有3 只小鼠死亡；给药期间中药组和模型组各有2 只小鼠死亡。手术结束后，除假手术组，其他两组小鼠均出现精神倦怠、纳食减少和行动缓慢等现象。随试验进行，各组小鼠逃避潜伏期逐渐缩短；第2～5 天，与假手术组比较，模型组逃避潜伏期显著延长（P＜0.01）；与模型组比较，中药组逃避潜伏期显著缩短（P＜0.01）。试验第6 天，与假手术组相比，模型组和中药组跨越平台次数和停留在第Ⅲ象限的时间均显著减少（均P＜0.01）；与模型组相比，中药组1 min 内跨越第Ⅲ象限平台次数和在第Ⅲ象限停留的时间均显著增加（均P＜0.01），见表1。

2.2 差异蛋白的鉴定结果 质谱分析共得到蛋白质二级谱图数841 588 个，有效谱图数393 081 个；鉴定到的肽段总数52 206 条，特异性肽段数50 097 条，鉴定到的蛋白质总数5 236个。蛋白质肽段长度多为8～19 kD，处于合理范围内，约70%的肽段得分＞60分，大部分蛋白质对应1个以上的特异性肽段，说明结果精确可信。

2.3 差异蛋白的表达情况 3 组共筛选出152 个差异蛋白，其中模型组与中药组间65 个，包括表达上调蛋白39 个，表达下调蛋白26 个；模型组与假手术组间53个，包括表达上调蛋白32 个，表达下调蛋白21 个。聚类分析结果显示，在模型组中上调或下调的蛋白，在假手术组、中药组中表达相反，可见差异表达的蛋白可以有效地区分各组，见图1（插页）。

图1 差异蛋白表达的聚类热图

2.4 GO 富集分析 模型组和中药组间的差异蛋白主要涉及血浆脂蛋白的清除、细胞钙离子稳态、突触膜粘附、神经递质的分泌、氮化合物代谢等生物过程；差异蛋白主要位于胞内体、质膜外侧、突触前膜等位置，与胆固醇结合、蛋白结合、离子结合、酶活性等分子功能相关，见图2（插页）。

图2 GO 富集分析（A：生物过程分析；B：细胞组分分析；C：分子功能分析）

2.5 KEGG 富集分析和PPI 分析 KEGG 富集分析结果显示，模型组和中药组间的差异蛋白涉及维生素消化和吸收、丙酮酸代谢、谷氨酸突触、代谢通路、神经退行性变通路等信号通路，见图3。将模型组与中药组之间的差异蛋白导入STRING 数据库构建PPI 网络，结果显示该网络中共有55个节点，128条边。主要差异蛋白质有参与谷氨酸突触信号通路的代谢性谷氨酸受体2（metabotropic glutamate receptor 2，Grm2），与氧化磷酸化相关的细胞色素c 氧化酶亚基7C（cytochrome c oxidase subunit 7C，Cox7C），调节细胞离子稳态的蛋白偶联锌反转运蛋白Slc30a1（proton-coupled zinc antiporter Slc30a1，Slc30a1）也在其中，见图4。使用Cytoscape 3.9.1 软件的cytoHubba 插件可筛选出关键蛋白，关键蛋白为差异表达基因集合中具有最强调控作用的基因，见图5。

图3 KEGG 通路富集结果（A：通路分类图；B：KEGG 富集点线图）

图5 关键蛋白网络图

3 讨论

VD 是一种复杂的脑部疾病，脑血管损伤导致脑灌注减少可能是VD 的潜在机制。研究认为，脑灌注减少时，氧气和能量供应减少，直接导致线粒体功能障碍和离子失衡，之后神经兴奋性毒性、氧化应激等分子机制被激活[13]。Olloquequi 等[14]认为，兴奋性谷氨酸受体过度激活引起神经元功能障碍或死亡，导致中枢神经系统处于兴奋性毒性状态，这可能与VD 的发病相关。差异蛋白Grm2 可降低由氧化应激介导的兴奋性毒性，减少神经元死亡，改善认知功能[15]。健脾填精方减轻兴奋性毒性的作用机制可能与活性成分人参皂苷、白术内酯Ⅲ有关。研究发现，人参皂苷通过抑制星形胶质细胞兴奋性毒性而发挥保护神经和增强认知的作用[16]。白术内酯Ⅲ可通过抑制半胱天冬酶信号通路，减轻谷氨酸诱导的神经元凋亡，从而发挥神经保护作用[17]。

缺氧条件下，线粒体功能障碍可引发能量代谢异常，活性氧与抗氧化剂之间的平衡被打破，自由基增多，引起氧化应激反应，导致神经元细胞死亡，这可能是VD 发病的原因之一[18]。差异蛋白Cox7C 能够促进ATP 合成，减少线粒体功能障碍的发生，减轻氧化应激反应[19]。健脾填精方减轻氧化应激的作用机制可能与活性成分白术内酯、巴戟天低聚糖有关。白术内酯可减少活性氧形成，减轻氧化损伤，增加记忆相关蛋白，如突触素I 和蛋白激酶C 的表达，从而改善记忆能力[20]。Chen 等[21]研究发现巴戟天低聚糖可抑制痴呆模型大鼠海马CA1 脑区、皮质和前脑基底核神经元细胞减少，增强抗氧化能力并防止自由基损伤，提高大鼠学习记忆能力。本研究发现，中药组小鼠脑组织中Grm2、Cox7C 表达上调，说明健脾填精方可能通过减轻神经系统兴奋性毒性、抗氧化应激和减轻线粒体功能障碍从而发挥改善VD 的作用。

动脉粥样硬化可能是VD 发生的原因之一，鸟苷酸环化酶可溶性亚基α-3（guanylate cyclase soluble subunit alpha-3，Gucy1a3）能防止动脉粥样硬化的发生[22-23]。Gucy1a3 编码可溶性鸟苷酸环化酶的α1 亚基，可溶性鸟苷酸环化酶复合体是一氧化氮受体，可催化环状鸟苷3'，5'-单磷酸酯（Guanosine-3'，5'-cyclic monophosphate，cGMP）的形成，cGMP 可调节神经传递、松弛血管平滑肌细胞和抑制血小板聚集等生理过程[24]。健脾填精方中的黄连素是从中药黄连中分离的一种季铵生物碱，可改善动脉粥样硬化血管内皮损伤[25]。经健脾填精方干预的小鼠脑组织中Gucy1a3 表达上调，而模型组小鼠脑组织中Gucy1a3 的表达无明显变化，说明健脾填精方可能通过上调Gucy1a3 的表达，发挥防治VD 的作用。

脑缺血时，突触活动增强引起锌离子（Zn2+）释放增加，细胞内高水平的Zn2+可对神经元、神经胶质细胞产生毒性，最终导致神经元或神经胶质细胞快速死亡[26]。差异蛋白Slc30a1 参与了调节细胞离子稳态的过程。Slc30a1 是Zn2+吸收和转运的关键调控因子，其表达增多可降低神经元、神经胶质细胞内Zn2+水平，使其免受Zn2+中毒的影响，维持Zn2+稳态，减少神经细胞死亡[27]。天麻的主要生物活性成分天麻素可以抑制Zn2+诱导的细胞死亡，保护星形胶质细胞免受Zn2+的毒性影响和氧化应激损伤[28]。经健脾填精方治疗的VD 小鼠脑组织Slc30a1 水平明显增加，证实了健脾填精方可通过调节细胞离子稳态，保护神经元。

除人参皂苷、白术内酯、巴戟天低聚糖类、黄连素、天麻素等活性成分外，健脾填精方中还可能存在其他活性成分，但是否对改善VD 有利还需进一步证实。总之，健脾填精方对小鼠脑组织蛋白的影响可能涉及Grm2、Cox7C、Gucy1a3、Slc30a1 等关键蛋白，通过减轻兴奋性毒性、抗氧化应激、减轻线粒体功能障碍、抗动脉粥样硬化、调节细胞离子稳态等途径，起到改善VD 的作用。