基于多指标综合评分法优选茅莓根水提工艺∗

黄贵发，王瑜婷，钟 霞，余欣彤，徐东婷，邱彩月，陈江平

广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244

茅莓根为蔷薇科悬钩子属植物茅莓Rubus parvifolliusL.的干燥根，又名红梅消、大暑莓、蛇泡簕、乌泡根，为民间常用中草药，资源丰富，主产于广东、山东、河南、广西等地，具有清热解毒、祛风利湿、活血凉血的功效，用于感冒发热、咽喉肿痛、风湿痹痛、湿热黄疸、热毒泻痢等症［1-5］。茅莓根收载于1977 年版《中华人民共和国药典》一部，之后各版均未记载，茅莓根为2020 年版《中华人民共和国药典》一部成方制剂鼻咽灵片和鼻咽清毒颗粒的主要组成之一［6］。现代研究表明，茅莓根的化学成分主要有黄酮、二萜、三萜及三萜皂苷类成分，其中黄酮类成分表儿茶素具有保肝、抗癌、抗氧化的药理作用［7-10］。目前，国内外对茅莓根的研究较少，主要集中在药材化学成分和质量控制方面，鲜见茅莓根制剂相关研究报道［11-12］。本研究以水为提取溶剂，采用煎煮法提取，以浸泡时间、加水量、煎煮次数和煎煮时间4个因素设计L9（34）正交试验，以干膏得率和表儿茶素含量为质量评价指标，权重系数分别设为0.7、0.3进行综合评价，筛选出最佳水提工艺，为茅莓根相关制剂的进一步开发提供依据。

1 材料

1.1 仪器Waters Arc 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；Milli-Q Direct 型超纯水系统（德国Merck公司）；ME204E型万分之一天平、XP26型百万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TC-15 型套式恒温器（海宁市新华医疗器械厂）；HWS-28 型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；YRE-501 型旋转蒸发器、SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵、DLSB-5L/20 型低温冷却液循环泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；DHG-9146A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）。

1.2 试剂与试药表儿茶素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110878-200102）；甲醇（德国Merck 公司，色谱纯）；N，N-二甲基甲酰胺（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）；水为超纯水，其他试剂为分析纯；茅莓根药材（批号：Y200601）产地为广东，经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为正品，符合《广东省中药材标准（第三册）》茅莓根项下相关要求［1］。

2 方法与结果

2.1 水提液制备取茅莓根饮片适量，分成9份，每份约100 g，按正交试验设计进行回流提取，滤过，分别合并每组试验的水提液，减压浓缩，定容至50 mL，得样品浓缩液。

2.2 干膏得率测定精密吸取茅莓根水提液25 mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105 ℃烘箱内干燥3 h，取出，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，干膏得率计算公式：

2.3 表儿茶素含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱为YMC Triart C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为：（0.04 mol/L枸橼酸溶液-N，N-二甲基甲酰胺=45∶8）-甲醇=98∶2；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL。

2.3.2 对照品溶液制备 取表儿茶素对照品适量，精密称定，加入50%甲醇制成每1 mL含表儿茶素0.05 mg的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液制备 精密吸取样品浓缩液2 mL 至50 mL 量瓶中，加入50%甲醇适量，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇定容至50 mL，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 专属性考察 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及空白溶剂适量，按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。表儿茶素对照品溶液在33 min左右出峰，供试品溶液在相应时间有峰与之对应，而空白溶剂在33 min 左右无峰，表明其对表儿茶素的测定无干扰，该方法专属性良好。见图1。

图1 高效液相色谱图

2.3.5 线性关系考察 精密称取表儿茶素对照品7.522 mg，加50%甲醇定容至25 mL，制成浓度为300.88 μg/mL的表儿茶素对照品母液，分别取0.5、1、2、5、8、10 mL对照品母液置10 mL量瓶中，用50%甲醇定容到刻度，得一系列对照品溶液，浓度 分 别 为15.044、30.088、60.176、150.440、240.704、300.88 μg/mL，按上述色谱条件进样测定，以对照品溶液浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得表儿茶素回归方程为Y=8972.9095X-12390.3725（r2=0.9998），说明表儿茶素在15.044～300.88 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.6 精密度考察 取“2.3.5”项下浓度为60.176 μg/mL 的对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，计算表儿茶素峰面积的RSD为0.37%，说明仪器精密度良好。

2.3.7 重复性考察 取同一样品浓缩液，按“2.3.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，计算表儿茶素峰面积的RSD为0.76%，说明该方法重复性良好。

2.3.8 稳定性考察 取同一供试品溶液，于制备0、2、4、8、12、24 h 后按上述色谱条件进样测定，计算表儿茶素峰面积的RSD为0.79%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.9 加样回收试验 取已知含量的样品浓缩液适量，精密吸取9 份，每份1.0 mL，置于50 mL量瓶中，分为3 组，分别按高、中、低浓度精密加入表儿茶素对照品溶液适量，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，计算平均加样回收率为101.7%，RSD 为2.57%，说明该方法准确度良好，见表1。

表1 表儿茶素加样回收率试验结果（n=9）

2.4 水提工艺优化

2.4.1 正交试验 采用L9（34）正交试验优选茅莓根水提工艺。以干膏得率和表儿茶素含量为质量评价指标，结合前期单因素考察的试验结果，选取浸泡时间（A）、加水量（B）、煎煮时间（C）和煎煮次数（D）为考察对象，因素水平设计见表2。

表2 因素水平设计

2.4.2 数据处理 多指标试验综合加权评分法是将试验结果进行归一化处理后，根据各项评价指标在整个试验中的重要性，设定不同权重进行评分的一种方法，在保证分析指标较为全面的同时，对于关键影响因素又给予了相应侧重，使结果分析更加全面、科学、合理［13-16］。本研究将各项指标的结果通过归一化处理后，设定干膏得率和表儿茶素含量的权重系数分别为0.7、0.3，得到综合评分，归一化值=（指标值-指标最小值）/（指标最大值-指标最小值）［17-19］；综合评分=干膏得率归一化值×70%+表儿茶素归一化值×30%。见表3—4。

表3 茅莓根水提工艺正交直观分析

表4 茅莓根水提工艺正交方差分析

由直观分析得出，影响因素D＞C＞B＞A，即煎煮次数＞煎煮时间＞加水量＞浸泡时间，其中，A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，D3＞D2＞D1，最优组合为A2B3C2D3；方差分析表明煎煮次数（D）对试验结果有显著影响（P＜0.05），浸泡时间（A）、加水量（B）、煎煮时间（C）3 个因素对试验结果无显著影响（P＞0.05），在实际生产中，从节约自然资源、提高生产效率等方面考虑，确定最佳水提工艺为A1B2C1D3，即加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮3次，每次0.5 h。

2.4.3 验证试验 称取茅莓根饮片3 份，每份约100 g，按优选的水提工艺进行回流提取，结果表明，验证试验各指标的RSD均小于2%，说明优选的茅莓根水提工艺稳定可行。见表5。

表5 验证试验结果（n=3）

3 讨论

本研究在表儿茶素HPLC 含量测定方法的建立过程中，对不同厂家和型号的色谱柱（Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBRIDGE C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和YMC Triart C18（150 mm×4.6 mm，5 μm））进行考察，分别比较了各色谱柱的出峰时间、峰型、分离度以及适用性，最终确定YMC Triart C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）为本研究方法的色谱柱；在进行流动相比例的选择时，曾采用甲醇-0.01 mol/L 枸橼酸（20∶80）进行测定［20］，分离效果差，后参考儿茶中表儿茶素含量测定方法［6］，加入一定比例N，N-二甲基甲酰胺，采用甲醇-（0.04 mol/L 枸橼酸-N，N-二甲基甲酰胺=45∶8）比例分别为（5∶95）（3∶97）（2∶98）等进行测定，最后选定（2∶98）比例，在此条件下表儿茶素的分离效果和出峰时间均较好。

本研究以干膏得率结合表儿茶素含量，并采用综合评分法结合正交设计优选出茅莓根的水提工艺。文献表明，茅莓根中还含有大量三萜及皂苷类成分［7］，仅以表儿茶素含量作为优选水提工艺的质量指标略有不足，因此，在后续研究中，可将表儿茶素含量结合三萜及皂苷类成分含量作为质量指标进行综合评价，从而更客观反映水提工艺的优劣，为茅莓根的相关制剂研究提供依据。