基于PI3K/Akt 通路探讨鹿茸促进下肢动脉硬化闭塞症大鼠血管新生的作用机理∗

李子娟，王雁彬，韩 杰，张晓园，李廷荃△

1 山西中医药大学中医临床学院，山西 太原 030024；2 山西中医药大学附属医院，山西 太原 030024； 3 山西省中医院，山西 太原 030000

下肢动脉硬化闭塞症（arteriosclerosis obliterans of the lower extremities，ASOLE）是指由于动脉硬化造成的内膜增厚、管腔狭窄或闭塞，导致相应区域供血不足的一系列疾病，主要表现为下肢皮温降低、间歇性跛行、疼痛，易引起肢体末端坏疽，导致截肢［1-2］。鹿茸具有补肾、填精、益髓的功效［3］，前期研究表明，鹿茸能够促进ASOLE大鼠血管新生［4］，但具体机制尚未明晰。磷脂酰肌醇3-羟基激酶（phosphatidy linositol 3-hydroxykinase，PI3K）是蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)的上游信号分子，可通过激活Akt 来调节细胞内信号通路和细胞功能变化，在血管新生中发挥重要作用［5-6］。本实验通过检测ASOLE模型大鼠血清中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、缺氧诱导因子1α多肽（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α）的含量以及骨髓中EPCs 凋亡率与腓肠肌中血管内皮细胞生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）的阳性表达探讨鹿茸通过PI3K/Akt信号通路促进ASOLE大鼠血管新生的作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物SPF 级雄性SD 大鼠92 只，2 月龄，体质量250～300 g，由山西省中医药研究院提供，实验动物质量合格证号：1103221911003889。

1.2 饲料制备高脂饲料（80.3%基础饲料、15%猪油、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、4%胆固醇）。

1.3 药物与试剂鹿茸采用马鹿茸，购自北京同仁堂（集团）有限责任公司，用普通粉碎机粗粉后再用气流超微粉碎机制成微粉（粒径＞10 μm），温水调，搅拌均匀，即用即配。PI3K抑制剂LY294002购于美国Selleck公司中国分公司（美国辉瑞公司授权经销商），用DMSO 配置母液（10 mg LY294002溶于6.5075 mL DMSO），于-20 ℃冰箱保存，每日配置当日所需溶液（10%母液+40%PEG300+5%Tween-80+45%生理盐水），即用即配；维生素D3针剂（哈尔滨摩天农科兽药有限责任公司，批号：20190318）；ELISA试剂盒（Elabscience 公司，货号E-EL-R2603c）；VEGF抗体、HIF-1α抗体（abcam公司，货号：145056）；TUNEL 试剂盒（凯基生物科技有限公司，批号：20200623）。

1.4 仪器微型高速离心机（Labnet 公司，美国）；电热恒温培养箱（ASONE 公司，日本）；全自动酶标仪（Thermo scientific 公司，美国）；显微镜（奥林巴斯公司，日本）；切片机（莱卡公司，德国）；离心机（北京离心机厂）；电子天平（METTER 公司，瑞士）；移液器（EPPENDORF 公司德国）；干燥箱、低温冰箱（三洋公司，日本）；恒温水浴箱（江苏太仓医用仪器厂）；医用微波炉（浙江临安爱迪仪器厂）；脱水机、包埋机、冻台（武汉俊杰电子有限公司）；病理切片机（上海徕卡科技有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 分组 采用随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组，每组10 只，鹿茸低、中、高剂量组及LY294002+鹿茸低、中、高剂量组，每组12只。

1.5.2 下肢动脉硬化闭塞症模型制作 1）将大鼠以5%水合氯醛溶液（7 mL/kg）腹腔麻醉，随后取平卧位，固定于手术台，左侧腹股沟备皮；2）碘伏消毒左侧腹股沟区域后，行一长约1.5 cm 纵切口，暴露血管鞘，分离股动脉及其分支，齿镊沿股动脉走形钳夹约30 s，分别结扎并离断左侧股动脉分支；3）用0 号线缝合皮下组织及皮肤，背部皮下注射生理盐水10 mL 补液抗休克治疗，大鼠各项生命体征平稳后放回鼠笼；4）30万单位青霉素肌肉注射3天预防感染；5）高脂饲料喂养12周；6）予维生素D3（30万U/kg）右下肢肌肉注射，每月1次［7］。

1.5.3 给药方法 鹿茸低、中、高计量组分别灌胃［0.143、0.286、0.572 g/（kg·d）］鹿茸溶液。LY294002 组腹腔注射LY294002［1 mg/（kg·d）］；正常组、模型组及假手术组灌胃等容量蒸馏水。LY294002+鹿茸低、中、高计量组先腹腔注射LY294002 再灌胃鹿茸溶液。于造模第一天开始给药，每日1次，28天后处死大鼠。

1.5.4 标本采集及处理方法 将大鼠麻醉后，用小镊子摘去一只眼球，收集外周血到EP 管中；取大鼠术侧下肢腓肠肌，立即冻存于液氮中，并存储于-70 ℃冰箱待用。

1.6 检测指标

1.6.1 一般状态 观察大鼠一般状态，包括精神状态、毛色、皮温及活动灵敏度等。

1.6.2 大鼠外周血清中VEGF、HIF-1α含量ELISA检测 实验开始前，各试剂均平衡至室温；试剂或样品配制时需充分混匀，并尽量避免起泡；分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品或样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL。给酶标板覆膜，37 ℃孵育90 min；弃去孔内液体，甩干，不洗板，每孔中加入生物素抗体溶液100 μL，酶标板加覆膜，37 ℃温育1 h；弃去液体，洗板3次，每次浸泡30 s，大约350 μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；每孔加酶结合物溶液100 μL，加覆膜，37 ℃温育30 min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加底物溶液（TMB）90 μL，酶标板加覆膜37 ℃避光孵育15 min 左右。当标准孔出现明显梯度时每孔加终止液50 μL，终止反应；立即用酶标仪在450 nm 波长处测量各孔光密度（OD值）。

1.6.3 骨髓中EPCs 凋亡率TUNEL 检测 标本经分层离心涂片后：1）4%多聚甲醛固定30 min；样本 片 浸 入PBS 漂 洗3 次，每 次5 min；2）配 置1%Triton X-100 通透液，将样本片浸入通透液中，室温促渗3～5 min；之后浸入PBS 漂洗3 次，每次5 min；3）配置3% H2O2封闭液，样本片浸入封闭液中，室温（15～25 ℃）封闭10 min；样本片浸入PBS 漂洗3 次，每次5 min；4）配置TdT 酶反应液，每个样本滴加50 μL TdT酶反应液，加盖玻片放入温盒中，37 ℃避光反应30 min；反应后得样片浸入PBS 漂洗3 次，每次5 min；5）每个样本滴加50 μL 避光配置的Streptavidin-HRP 溶液，37 ℃避光反应30 min；反应后的样片浸入PBS漂洗3 次，每次5 min；6）配置DAB 溶液显色；7）苏木素轻度复染。脱水，透明，封片后荧光显微镜下观察；每例切片计数5 个200 倍视野，以平均每100个细胞中所含凋亡细胞个数计算凋亡率。

1.6.4 腓肠肌中VEGFR含量免疫荧光技术检测 涂片后用多聚甲醛固定10 min；用PBS 溶液微振荡洗涤5 min×2次。加0.4% Triton-X100破膜5～10 min，用PBS 微振荡洗涤3 min×3 次；用1%PBS封闭液室温封闭30 min～1 h；用0.5% PBS 稀释一抗，比例为1∶100；4 ℃过夜；从冰箱拿出后37 ℃复温45 min；或室温2～3 h；或37 ℃ 1 h；孵育后用PBS 微振荡洗涤5 min×3 次；用0.5%PBS稀释二抗，比例为1∶400；室温30 min 1 h；孵育后用PBS 微振荡洗涤5 min×3 次；DAPI 原液为1 g/mL，稀释浓度为1∶1000，快速染色10 s，用蒸馏水冲洗；用防淬灭的封片剂封片，荧光显微镜高倍视野下观察。

1.7 统计学方法应用SPSS 25.0 分析数据，计量资料以表示，采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状态空白组、假手术组大鼠精神良好，毛色光泽，活动灵敏，下肢温度正常；模型组、各给药组大鼠最初1 个月增长迅速，后增长减缓，且精神萎靡，活动欠灵敏，毛色暗淡，下肢温度降低。

2.2 外周血清中VEGF与HlF-1α含量与空白组相比，模型组及各给药组VEGF及HIF-1α水平降低（P＜0.01），各给药组VEGF 及HIF-1α水平高于模型组（P＜0.01）；其中鹿茸高剂量组最显著，且高于鹿茸高剂量+LY294002 组（P＜0.01）；鹿茸高剂量+LY294002组高于鹿茸中剂量组（P＜0.05）；鹿茸中剂量组高于鹿茸中剂量+LY294002组（P＜0.05）；鹿茸中剂量+LY294002 组高于鹿茸低剂量组（P＜0.05）；鹿茸低剂量组高于鹿茸低剂量+LY294002组（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠外周血清中VEGF、HlF-1α含量（）

表1 各组大鼠外周血清中VEGF、HlF-1α含量（）

注：与空白组比较，▲▲表示P＜0.01，▲表示P＜0.05；与模型组比较，△△表示P＜0.01，△表示P＜0.05；与鹿茸高剂量组比较，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

HIF-1α 51.73±3.61△△*41.11±4.01▲△△34.39±0.37▲▲△△**32.96±0.44▲▲△△*28.09±1.87▲▲△△**24.03±0.82▲▲△△**21.52±0.94▲▲△**18.84±1.27▲▲**组别空白组鹿茸高剂量组鹿茸高剂量+LY294002组鹿茸中剂量组鹿茸中剂量+LY294002组鹿茸低剂量组鹿茸低剂量+LY294002组模型组鼠数6 6 6 6 6 6 6 6 VEGF 111.35±7.69△△**85.56±4.65▲▲△△72.78±0.98▲▲△△**67.55±2.29▲▲△△**61.97±0.79▲▲△△**59.16±0.78▲▲△△**54.22±0.99▲▲△△**50.85±0.18▲▲**

2.3 骨髓中EPCs 凋亡率 与空白组及各给药组比较，模型组骨髓EPCs 凋亡率上升（P＜0.01）；与空白组相比，鹿茸高剂量组骨髓中EPCs凋亡率无显著差异（P＞0.05），其中鹿茸高剂量组低于鹿茸高剂量+LY294002组（P＜0.05），鹿茸高剂量+LY294002组低于鹿茸中剂量组（P＜0.01），鹿茸中剂量组低于鹿茸中剂量+LY294002组（P＜0.05），鹿茸中剂量+LY294002 组低于鹿茸低剂量组（P＜0.01），鹿茸低剂量组低于鹿茸低剂量+LY294002组（P＜0.01）。见表2。

表2 TUNEL检测给药后骨髓中EPCs凋亡率（）

表2 TUNEL检测给药后骨髓中EPCs凋亡率（）

注：与空白组比较，▲▲表示P＜0.01，▲表示P＜0.05；与模型组比较，△△表示P＜0.01，△表示P＜0.05；与鹿茸高剂量组比较，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

EPCs凋亡率8.2±2.86△△7.8±2.59△△11.6±0.90▲△△*15.8±1.92▲▲△△**18.4±1.14▲▲△△**21.4±1.52▲▲△△**26.2±2.28▲▲△△**38.6±4.72▲▲**组别空白组鹿茸高剂量组鹿茸高剂量+LY294002组鹿茸中剂量组鹿茸中剂量+LY294002组鹿茸低剂量组鹿茸低剂量+LY294002组模型组鼠数55555555

2.4 腓肠肌中VEGFR 阳性表达 模型组及各给药组VEGFR阳性表达低于空白组（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组VEGFR阳性表达升高（P＜0.05）；其中各给药组VEGFR 阳性表达由高到低依次为鹿茸高剂量组、鹿茸高剂量+LY294002 组、鹿茸中剂量组、鹿茸中剂量+LY294002 组、鹿茸低剂量组、鹿茸低剂量+LY294002 组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1—2。

图1 免疫荧光法测定腓肠肌中VEGFR阳性表达比例

图2 腓肠肌中VEGFR阳性表达（免疫荧光法）

3 讨论

动脉硬化闭塞症（arteriosclerosis obliterans，ASO）是由于血管动脉粥样硬化斑块的不断扩大和继发血栓引起动脉管腔狭窄甚至闭塞，出现患肢慢性或急性缺血症状［8-10］。因此，改善缺血区域血流灌注促进血管新生成为治疗的重要步骤之一。现代研究认为，鹿茸可促进血液生成和运行，而鹿茸的主要成分鹿茸多肽对表皮细胞及成纤维细胞有促进增殖作用，可以加速疮面愈合，促进血管内皮细胞增殖分化及迁移，促进病变部位血管生成［11］。

HIF-1α是维持内环境氧平衡的核心调控因子，调控一系列缺氧相关基因的表达，HIF-1α结合VEGF基因并启动转录过程，最终导致VEGF在细胞内累积［12］，VEGF 是促进血管生成的重要因子，通过与内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）表面的VEGFR 结合，诱导下游促细胞存活相关通路激活，如PI3K/Akt信号通路，以促进EPCs 增殖［13-14］。EPCs 来源于骨髓，具有自我增殖和多向分化潜能，并可分化为血管内皮细胞，不仅参与胚胎时期血管新生，同时也在成人血管新生中发挥关键作用［15］。LY294002 是常见的PI3K/Akt信号通路阻断剂，可完全抑制PI3K 磷酸化，从而阻断PI3K/Akt通路影响血管生成［16-17］。

本实验结果显示，大鼠血清中HIF-1α、VEGF含量以及腓肠肌中VEGFR 阳性表达鹿茸高剂量组最高，鹿茸中剂量组与鹿茸低剂量组依次降低，同时PI3K/Akt 抑制剂LY294002 组HIF-1α、VEGF 含量和VEGFR 阳性表达低于相应鹿茸剂量组；骨髓中EPCs 凋亡率鹿茸高剂量组最低，鹿茸中剂量与低剂量依次升高，含有LY294002组EPCs凋亡率高于同剂量对应组，表明使用LY294002 抑制剂组效果差于同剂量未使用LY294002 组，其差异有统计学意义（P＜0.05）。且鹿茸高剂量组效果优于其余各组，接近空白组水平。可见，鹿茸通过刺激PI3K/Akt 信号通路提高了HIF-1α、VEGF 表达，增加了VEGF 含量，VEGF 与VEGFR 结合，促进了EPCs细胞增殖，最终促进ASOLE 大鼠血管新生。而其具体机制还需通过PI3K/Akt 信号通路其余关键蛋白进行检验。