基于复杂网络技术分析“北沙参-桔梗”治疗放射性肺炎的机制∗

马思遥，任延毅，王雪冰

中国医科大学肿瘤医院/辽宁省肿瘤医院，辽宁 沈阳 100042

放射性肺炎是胸部恶性肿瘤放疗后的常见并发症，普遍认为，早期多种细胞因子相互作用诱导的炎症反应及后期不可逆的纤维化形成是其主要病理过程［1-2］。“久咳肺虚……或咳血线，口中有浊唾涎沫，脉数而虚，为肺痿之病”“痿者，萎也，如草木之枯萎不荣，为津涸而肺焦也”。中医多将放射性肺炎归为“肺痿”范畴。中医认为放射性肺炎属本虚标实，其发生发展的病机根本在于火热之邪耗伤阴血，乃致治节不利，肺叶焦枯，瘀血内阻［3］。治则多从养肺阴、清肺热、利肺气立论。北沙参味甘、苦、微寒，归肺胃经，养阴清肺，“善治一切阴虚火炎”，用于治疗肺热燥咳、久咳肺痿、津伤口渴等症；桔梗味苦辛，性平，归肺经，具有利咽排脓、通利肺气之功，为“肺病之舟楫”［4］。故“北沙参-桔梗”常作为配伍药对出现于放射性肺炎的治疗主方中。但由于中药成分复杂，其作用机制及作用靶点不明确，不利于进一步深入研究。本研究通过“药物-疾病-基因-靶点-通路”，从网络药理学角度探讨中药在分子层面的作用机制，为中药治疗放射性肺炎提供客观依据。

1 资料与方法

1.1 中药有效成分与靶点基因筛选口服生物利用度（oral bioavailability，OB）［5］是判断口服药物化学成分药效活性的药动学参数，是药物进入血液循环的相对速率，反映药物吸收、代谢的过程。类药性（Drug-likeness，DL）［6］是化合物与已知药物的相似性，DL≥0.18 的化合物被认为有较好的类药性。本研究选择中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）［7］按OB≥30%、DL≥0.18 的条件筛选“北沙参-桔梗”的潜在有效成分及其对应的靶点蛋白。在人类基因数据库（the human gene database，GeneCards）（http：//www.genecards.org/）［8］中输入关键词”Radiation pneumonia”，搜索已知与放射性肺炎关联的靶基因。对筛选得到的“北沙参-桔梗”靶点和放射性肺炎作用基因进行匹配，获得靶点基因（交集基因）。

1.2 化合物-靶点网络图的描绘将中药、有效成分、靶点基因、疾病数据导入Cytoscape 软件描绘有效成分-靶点网络图。网络图中不同形状的节点分别显示中药、有效成分、疾病及靶点基因，节点之间连线表示中药-有效成分、有效成分-靶基因、疾病-靶基因的关联。

1.3 蛋白-蛋白相互作用网络(protein-protein interactions，PPl)分析将靶基因导入String数据平台［9］，物种选择为“Homo-sapiens”，high confidence=0.4，并隐藏游离靶点，绘制并下载PPI 网络图。根据PPI 网络中靶基因与其他基因的连线数找出PPI 网络中连接数较多的基因。度值（degree）和介数（betweenness）是判断网络节点重要性的主要参数，其数值越大，该节点在网络中越重要。

1.4 基因本体论功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）在R 语 言 环 境 下 安 装“clusterprofiler”，对靶点基因进行GO 和KEGG功能富集（P≤0.05，Q≤0.05），绘制主要富集结果的柱状图［10］。并根据富集结果探讨“北沙参-桔梗”治疗放射性肺炎的作用机理，进一步研究“北沙参-桔梗”治疗放射性肺炎的生物学功能及KEGG信号通路。

2 结果

2.1 中药-有效成分-共同靶点基因-疾病的网络分析共得到OB≥30%、DL≥0.18 的有效成分即“北沙参-桔梗”配伍潜在的靶点基因15个，见表1。

表1 北沙参-桔梗治疗放射性肺炎的潜在有效成分

通过检索GeneCard 数据库得到与放射性肺炎相关的基因，将中药的作用靶点基因和放射性肺炎的机制基因进行匹配，共得到124 个共同靶点基因（交集基因）。经Cytoscape 软件绘制得到“北沙参-桔梗”配伍中15 个化合物与124 个放射性肺炎靶点基因的网络图，图中红色代表药物“北沙参-桔梗”，黄色菱形代表疾病（放射性肺炎），黄色圆形代表靶点基因，粉色代表“北沙参-桔梗”药对潜在有效化学成分。可见，“北沙参-桔梗”配伍中一个有效成分可与多个靶点基因对应，而放射性肺炎的一个靶点亦可与多个化合物成分相关联。见图1。

图1 “北沙参-桔梗”配伍干预放射性肺炎的有效成分-靶点网络图

2.2 PPl 网络将数据导入STRING 数据库绘制PPI 网络图，一个节点表示一个靶点，节点内图形为基因转录的蛋白结构，蛋白结构未知的为空。两节点之间不同颜色连线表示两个基因的不同关系。PPI 网络中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（serine/threonine protein kinase 1，Akt1）、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor，VEGFA)、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen activated protein kinase 1，MAPK1)连接数较多，提示这些靶点是“北沙参-桔梗”干预放射性肺炎的核心机制。其中Akt1 与58 个其他靶点相连接，是PPI 网络中的核心靶点，其次分别为IL-6（50 基因）、VEGFA（47基因）、MAPK1（45基因）等。见图2—3。

图2 “北沙参-桔梗”配伍干预放射性肺炎靶点基因的PPI网络

图3 PPI网络中基因连接数柱状图

2.3 富集分析

2.3.1 GO 富集分析 共富集分析得到132 条P≤0.05 的生物过程。adjustP值越小，其可靠性越高，排名靠前的生物过程依次为：细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、泛素样蛋白连接酶结合（ubiquitin-like protein ligase binding）、血红素结合（heme binding）、泛素蛋白连接酶结合（ubiquitin protein ligase binding）、四吡咯结合（tetrapyrrole binding）、受体调节活性（receptor regulator activity）、蛋白质异二聚活性（protein heterodimerization activity）、受体配体活性（receptor ligand activity）、磷酸酶结合（phosphatase binding）、激酶调节活性（kinase regulator activity）、支架蛋白结合（scaffold protein binding）、生长因子受体结合（growth factor receptor binding）、丝氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、抗氧化活性（antioxidant activity）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）、BH 域绑定（BH domain binding）、丝氨酸型内肽酶活性（serinetype endopeptidase activity）、内 肽 酶 活 性（endopeptidase activity）。见图4。

图4 “北沙参-桔梗”配伍治疗放射性肺炎的GO富集分析

2.3.2 KEGG富集 共富集得到150条P≤0.05的信号通路，将KEGG 富集分析结果按校正P值排序，排名靠前的信号通路为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素17(interleukin-17，IL-17)、PI3K-Akt、HIF-1、C 型凝集素受体（Ctype lectin receptor，CLR）、松弛素（Relaxin）、Toll 样受体（Toll like receptor，TLR）、p53 及NF-kappa B等。见图5。

图5 “北沙参-桔梗”配伍治疗放射性肺炎的KEGG富集分析

3 讨论

放射性肺炎发生机制复杂，是多种炎症细胞及细胞因子共同参与、多种信号分子相互影响、多通路调节的复杂过程［11］。

本研究运用复杂网络技术，得到“北沙参-桔梗”中15 个化合物和与之相关的124 个放射性肺炎靶点基因，与中医“同病异治，异病同治”理论相符。其中Akt1 与58 个靶点相连接，是PPI 网络中的核心靶点，IL-6、VEGFA、MAPK1 和JUN 位于网络相对中心位置，被认为是放射性肺炎的潜在重要靶点。通过GO 富集分析发现“北沙参-桔梗”药对主要参与细胞因子活化、抗氧化、免疫调节等生物学过程；通过KEGG富集分析得到TNF、IL-17、PI3KAkt、HIF-1、TLR、p53、NF-kappa B等信号通路。这些靶点及信号通路均是“北沙参-桔梗”治疗放射性肺炎发生生物过程的潜在靶点及通路，体现了该药对多成分、多靶点、多途径的作用特点。

PI3K/Akt是蛋白激酶耦联受体介导的经典信号通路，Akt1是一种参与细胞代谢、增殖、上皮化生等多种生物学过程的蛋白，是PI3K/Akt信号通路中的关键节点，也是呼吸道上皮细胞炎症反应的关键调节因子，活化的Akt能够通过活化下游因子，从而激活核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，促进放射性肺炎的发生［12-13］。此外PI3K/Akt信号通路能激活其下游mTOR，调控血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达。TNF-α是一个复合功能的细胞因子，可介导其他炎症因子表达，与TNFR2结合可激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路，增加炎症介质浸润［14-15］，并能刺激成纤维细胞增殖，促进肺纤维化进程。TP53可调控细胞凋亡，抑制NF-κB通路活化，负调控TNF-α等炎症因子分泌［16］。VEGF 主要作用于血管内皮细胞，增加毛细血管通透性，促进炎性细胞浸润，同时VEGF具有促进肺间质内分泌性胶原合成的作用，在肺纤维化过程中发挥作用［17-18］。IL-6 能促使浆细胞分泌抗体，刺激C反应蛋白合成，参与早期炎症反应。研究发现，IL-6 大量表达与PI3K/Akt 通路被激活有关［19-20］。MAPK信号通路是介导细胞反应的重要信号系统，可通过介导SAPK/JNK 通路产生级联反应，促进炎症细胞因子生成［21］。

北沙参为伞形科植物，其主要生物活性成分包括香豆素类、黄酮及酚酸类等，本研究中筛选出的香豆素类化合物包括别异欧前胡素（Alloisoimperatorin）、前胡内酯（Ammidin）、异欧前胡素（isoimperatorin）、佛手素（Bergapten）；黄酮及酚酸类包括槲皮素（Bergapten）；甾体类包括豆甾醇（Stigmasterol）［22-23］。多项研究证实北沙参中分离到的别异欧前胡素、异欧前胡素、佛手素及异欧前胡素口服给药代谢物欧前胡素等香豆素类化合物具有明确的祛痰镇咳、抗炎平喘及消除自由基、抗氧化、调节并提高免疫功能等作用［24-25］。黄酮类化合物槲皮素可通过下调小鼠肺组织SAPK/JNK表达，阻断MAPK 通路活化，减少IL-6、TNF-α 等细胞因子释放，抑制大鼠肺泡细胞凋亡，降低小鼠肺组织炎症反应程度，对肺损伤有保护作用。同时槲皮素的抗氧化作用可降低纤连蛋白表达，缓解肺组织上皮纤维化［26-27］。有研究发现，北沙参中分离出的豆甾醇具有抗炎活性［28］。2-O-甲基-3-Oβ-D-吡喃葡萄糖基桔梗酸A 二甲酯（Dimethyl-2-O-methyl-3-O-α-D-glucopyranosyl platycogenate A）和2-O-甲基-3-O-α-D-吡喃葡萄糖基桔梗酸A 二甲酯（2-O-methyl-3-O-α-D-glucopyranosyl platycogenate A）是桔梗中分离出的桔梗酸A，是桔梗主要的皂苷元，能抑制肺细胞中IL-6、TNF-α等细胞因子表达，下调肺组织中NF-κB蛋白表达［29-30］。桔梗中提取出的木犀草素能通过抑制NF-κB 蛋白表达，抑制IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-β等炎症细胞因子水平及趋化因子，从而起抗炎等活性作用［31］。

1 项以小鼠为研究对象的药理实验表明，北沙参具有镇咳、祛痰作用，能够延迟症状出现的时间，缓解症状严重程度［32］。亓润智等［3、33］通过动物实验发现放射性肺炎大鼠通过沙参桔梗汤干预后其支气管上皮细胞变性程度减轻，肺组织上皮细胞及血管内皮细胞损伤缓解，血管内皮通透性降低，炎性细胞浸润及肺间质渗出减少，同时沙参桔梗汤能降低IL-6 因子表达，疗效与剂量浓度呈正相关。杨玉莹等［34］通过动物实验发现沙参桔梗汤可降低炎症因子表达，且疗效与剂量相关。这些实验与本研究结果相符，为“北沙参-桔梗”通过影响IL-6 表达、VEGFA 靶点、抑制PI3K/Akt-Akt1 信号通路治疗放射性肺炎提供了组织病理学证据。TLR 是一种跨细胞膜免疫受体蛋白，其中TLR4 能激活NF-κB 信号通路，促进炎症因子释放。范滢［35］研究发现，桔梗提取物可能通过抑制TLR4 信号通路，减轻炎症反应，减少促炎细胞因子释放，同时通过抑制NLRP3 信号通路，阻断IL-6、IL-17等炎症因子的产生来改善肺纤维化所致炎症反应。另有多项实验表明，桔梗皂苷可通过下调IL-6、TNF-α和NF-κB 蛋白表达，抑制小鼠肺组织中炎症浸润和自由基生成，减轻气道重塑［27-28，36］。亦有研究发现，沙参中的异欧前胡素对大鼠成纤维样细胞的增殖抑制作用，可减少TNF-α炎症因子表达［37］。王丽芹［38］研究发现以沙参为代表的养阴药可通过抑制VEGF-mRNA 表达改善大鼠血管内皮通透性，维持血管稳态，减轻大鼠肺纤维化进程。李莹莹［39］研究发现经桔梗干预后肺组织的VEGFmRNA、TNF-α表达得到抑制，血管重构减少，通透性降低，肺泡断裂、融合、结构破坏及肺纤维化程度减轻。姚岚等［40-41］研究发现北沙参可下调博来霉素致肺纤维化大鼠TGF-β1及TNF-α蛋白表达，降低肺纤维化大鼠血清中纤连蛋白和层连蛋白含量，抑制成纤维细胞因子活化，维持肺泡和毛细血管基膜结构和功能完整，不仅在放射性肺炎早期减缓损伤发生，也对肺纤维化全过程有抑制作用。

综上所述，本研究结果与现代药物、动物实验结果相符，验证了“北沙参-桔梗”药对治疗放射性肺炎是多途径、多环节、多靶点的协同作用，其机制可能与抑制TNF-α、IL-6 等炎症因子表达，抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路及MAPK通路有关。