基于微量元素探讨气血双补方抗慢性心衰的炮制增效作用∗

王 琴，陈子端，陈林伟

南京中医药大学泰州附属医院，江苏 泰州 225300

气血双补方是著名中医学家孟景春教授的临床验方［1-5］，该方由人参、炙黄芪、酒当归、酒炒白芍、陈皮、玉竹、酒黄精、制首乌、枸杞子等9味中药组成，该方具有补益气血、通阳散结、活血通络、复脉固脱等功效，主要用于治疗慢性心衰（chronic heart failure，CHF）疾病［6］。课题组前期研究发现“气血双补方”中的黄芪、当归、白芍、何首乌、黄精炮制配伍后的复方特征图谱发生了显著变化，且临床研究发现炮制后治疗CHF的功效明显增强，但其炮制增效的作用机制尚不清楚，有待进一步研究。

微量元素又称痕量元素，是指小于人体体质量0.01%的元素，人体内共含有微量元素41种，必需微量元素14 种，虽然微量元素在体内总量很少，但其参与人体生命活动的各个环节，主要包括充当酶的辅基、参与核酸蛋白质代谢、抗肿瘤、生长发育、保护心血管、维护神经系统功能、提高机体免疫力等，目前生物无机化学在分子水平方面揭示了微量元素的体内作用机制，而微量元素含量测定为阐明中药作用机制提供一定参考。

前期研究发现气血双补方能降低CHF 模型大鼠体内丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量，提高总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）含量，对损伤心肌具有一定抗氧化保护作用［7］。同时对气血双补方中21种微量元素的测定结果表明复方中富含K、Ca、Na、Mg、Fe、Mn、Se、Al等微量元素，且研究表明SOD 依赖Cu、Zn、Fe 发挥生物活性，而Se 浓度与SOD 活性密切相关［8］。因此，本课题提出假说气血双补方炮制后是否通过调节体内微量元素增强对损伤心肌的抗氧化保护作用，进而对CHF 产生炮制增效作用。本研究拟通过比较CHF 模型大鼠灌胃生品和炮制品前后血清Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 14 种微量元素含量变化，阐释气血双补方抗CHF的炮制增效作用。

1 材料

1.1 实验动物健康SD 雄性大鼠20 只，体质量（220±20）g，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002，购自杭州医学院。

1.2 仪器WX-4000 型微波消解系统（上海屹尧微波化学技术有限公司）；ISO9001 型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；iCAP-6300 型电感耦合等离子发射光谱仪（美国Thermo Fisher Scientific）。ICP-AES工作条件见表1。

1.3 试剂Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 元素混合标准溶液（1 g/L，100 mL，国家有色金属及电子材料分析测试中心，批号：19603-1）；硝酸（分析纯，500 mL，南京化学试剂有限公司，批号：190722）；过氧化氢（分析纯，500 mL，南京化学试剂有限公司，批号：190802）；阿霉素（分析纯，上海源叶生物科技公司，批号：20191215）；水为经Millipore Milli-Q 水处理系统处理后的去离子水；气血双补生品和炮制品水煎液来自泰州市中医院药学部。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0软件分析数据，计量资料以表示，进行方差分析，采用SIMCA 14.1多元分析软件进行聚类分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 方法与结果

2.1 SD 大鼠心衰模型的建立及微量元素含量检测建立CHF 大鼠模型：将SD 大鼠置于正常实验环境适应性饲养，正常提供食物和水，保证12 h光照周期。将15 mg 阿霉素溶于4 mL 生理盐水中，配置浓度为3.75 mg/mL，大鼠腹腔注射给药剂量为2.5 mg/kg，大鼠给药体积约0.2 mL。两周内分6 次注射，累积剂量15 mg/kg，即2、4、6、8、10、12天给药，观察并确认大鼠心力衰竭症状。将CHF SD 模型大鼠20 只随机分为气血双补方生品组和炮制品组，每组10只，分别灌胃0.74 g/kg的复方生品及炮制品水煎液，每天灌胃3 次，灌胃4 周后眼眶取血检测血清Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 14 种微量元素含量。灌胃后两组大鼠血清Mg、Ca、Zn、Se 元素含量高于灌胃前（P＜0.05），炮制品组Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、Se 元素高于生品组（P＜0.05），说明气血双补方炮制前后微量元素含量发生了变化。进一步通过OPLS-DA 分析气血双补方炮制前后大鼠血清中差异性微量元素，同时建立VIP 图，由图得知气血双补方中差异性微量元素VIP＞1的元素主要有Fe、Mg、Ca、Zn、Se、Cu 及Mn 元素，表明大鼠血清中Fe、Mg、Ca、Zn、Se、Cu 及Mn 元素含量炮制后发生了显著变化。见图1—2及附表1。

图1 气血双补方炮制品与生品组大鼠血清聚类分析

图2 VIP图（OPLS-DA分析）

附表1 两组大鼠灌胃前后血清中各微量元素含量（n=10） μg/mL

2.2 样品测定精密量取两组血清样品溶液各0.2 mL 于聚四氟乙烯消解罐中，精密加入1 mL HNO3，1 mL 30%H2O2，密闭封装后，微波消解，140 ℃微波消解2 min，微波功率为500 W；然后升温至220 ℃，微波功率为1000 W，保持5 min，消解后冷却，移入5 mL 量瓶中，定容并摇匀，即得供试品溶液，按上述方法制备样品空白溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 将混合标准溶液（1 g/L）Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 多元素混合标准溶液）连续进样5次，计算各元素RSD范围均在1.12%～2.07%之间，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一血清样品平行测定5次，计算得到Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 各元素RSD 范围均在1.23%～2.21%之间，表明该检测方法稳定可靠。

2.3.3 稳定性试验 取混合标准溶液（1 g/L）Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba多元素混合标准溶液），分别在0、2、4、8、12、24 h进样6 次，计算各元素RSD 范围均在0.86%～1.25%之间，表明仪器稳定性良好。

2.3.4 加样回收试验 取已知含量的动物血清消解后的供试液，加入适量混合标准溶液，计算14 种元素的平均加样回收率范围为93.21%～104.82%，RSD为1.12%～2.64%（n=5）。

3 讨论

炮制改变了微量元素的质和量，能使人体必需微量元素溶出量增加，有害元素溶出量降低，并借助辅料中微量元素的作用更好地发挥中药材疗效［9］。并且炮制辅料中含有丰富的有机成分和无机微量元素，对药物的质量和疗效起重要作用［10］。目前关于中药中微量元素的功效尚不明确，其可能与有机成分并存形成配合物发挥药效有关。

本研究通过微量元素探讨气血双补方抗CHF的炮制增效作用，结果发现灌胃炮制品后CHF 动物模型大鼠血清中Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn及Se元素含量高于生品组。Cu、Zn、Se是人体重要的抗氧化酶金属离子，对心肌具有保护作用；研究表明SOD依赖Ca、Cu、Zn、Mg、Fe、Mn 元素发挥生物活性，而Se、Cu、Zn、Fe、Mn浓度与SOD活性密切相关。

综上所述，Fe、Ca、Zn、Se、Cu及Mn元素与抗氧化保护作用密切相关，与课题组前期研究发现气血双补方能降低CHF 模型大鼠体内MDA 含量，提高SOD 和GSH-Px 含量，对损伤心肌具有一定的抗氧化保护作用相吻合。因此，气血双补方炮制后可能通过提高Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn及Se元素含量进一步发挥抗CHF 的炮制增效作用，其更深层次作用机制有待进一步研究。