不同产地葛根微乳提取物对链脲佐菌素2 型糖尿病小鼠的降血糖作用探讨∗

田红艳，许蕊蕊

1 北京市怀柔区中医医院，北京 101400； 2 北京中医药大学中药学院，北京 102488

葛根（Puerariae lobatae radix）为豆科蝶形花亚科葛属野葛或甘葛地下块根，有悠久的药食两用记录，首次记载于汉代《本草经》［1］，于2000年被国际卫生组织列入“药食两用”名录。葛根味甘辛，性平，归脾胃经，有生津止渴、清火排毒作用［2-4］，其含有多种药效明确的活性成分，其中以黄酮类和多糖为主［5］，葛根黄酮类主要活性成分是葛根素、大豆甙元等。葛根黄酮类具有改善血液循环、降血压、抗氧化、降血糖和抗癌等作用，在糖尿病和心血管疾病及其相关并发症等的治疗中发挥良好作用［6］；葛根多糖具有抗氧化、降脂、降糖、免疫调节、解酒保肝、抑菌等多种生理功能［7］。虽然葛根黄酮类和多糖均表现出良好的抗氧化、降血糖等作用，但因二者水溶性的差异导致葛根传统提取工艺存在提取率低、费时、溶剂用量大、不环保等问题。与传统提取方法相比，微乳超声提取具有明显优势，这主要由于由油相、水相、表面活性剂和助表面活性剂组成的热力学稳定分散体系微乳，存在不同极性组成部位，且其液滴粒径在10～100 nm 之间，界面大，能促进微乳液体对各种药材中有效成分的接触及溶解，在提取水溶性成分的同时能更好提取脂溶性成分，对水溶性和脂溶性成分均表现出较高提取率［8-9］。

不同产地葛根临床降血糖作用差异较大。本研究以星点设计-效应面法优化葛根的微乳提取工艺，并考察湖南、陕西、湖北、山西4 个不同产地葛根微乳提取液对链脲佐菌素2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)小鼠的降血糖作用，为临床应用提供参考。

1 材料

1.1 仪器ME104E 型分析天平（上海微川精密仪器有限公司）；KH22R 型台式高速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；UV-2401PC 型紫外可见分光光度仪（日本岛津）；SK5200B 型低频台式超声波清洗器（上海量壹科学仪器有限公司）；GA-3型血糖仪及测试试纸（三诺生物传感有限公司）。

1.2 试药去离子水（实验室自制）；提取用微乳（实验室自制）；不同产地葛根（购于安国药材市场，经北京市怀柔区中医医院主任中药师王金荣鉴定，符合2015 年版《中华人民共和国药典》相关项下要求）；无水葡萄糖对照品（纯度：HPLC≥98%，批号：20190805）、芦丁对照品（纯度：HPLC≥98%，批号：20190810）、链脲佐菌素（纯度：HPLC≥98%，批号：20190723）、二甲双胍（纯度：HPLC≥98%，批号：20190811）及 生 理 盐 水（纯 度：0.9%，批 号：20190820）均由上海源叶生物科技有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 总多糖含量测定

2.1.1 标准曲线建立 于50 mL容量瓶中精密称取11.05 mg 无水葡萄糖对照品，加水溶解、定容得浓度为0.221 mg/mL 的葡萄糖对照品母液。用移液管分别精密移取该母液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL 于不同的25 mL 容量瓶中，分别加水至2 mL，按照苯酚-硫酸法处理，于490 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线方程得：Y=0.03587X+0.04214，r=0.9991，在0.884～11.492 μg/mL 范围内葡萄糖浓度X与吸光度Y具有良好的线性关系。

2.1.2 供试品溶液制备 精密量取一定量葛根微乳提取液，与150 mL乙醇混匀，于4 ℃放置12 h后，离心半径10 cm，4000 r/min，离心10 min，移弃上清液，沉淀移至50 mL容量瓶加水溶解。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 标准曲线建立 于50 mL 容量瓶中精密称取芦丁对照品12.02 mg，甲醇溶解定容得浓度为0.2404 mg/mL的芦丁对照品母液。分别精密吸取该母液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL置于不同的25 mL容量瓶中，按照亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法处理，于250 nm处测定吸光度。以芦丁浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线方程得：Y=6.0468X-0.0154，r=0.9992，在4.808～43.272 mg/mL 范围内芦丁浓度X与吸光度Y具有良好线性关系。

2.2.2 供试品溶液制备 精密量取葛根微乳提取液适量，加入甲醇破乳、定容到10 mL。

2.3 提取物得率[10]根据葡萄糖标准曲线和芦丁标准曲线，测定样品中葛根多糖和葛根总黄酮的吸光度，根据下列公式计算葛根总多糖提取率或葛根总黄酮提取率。

式中：C 为根据标准曲线求得的多糖浓度/黄酮浓度（g/mL）；V 为样品溶液的定容体积（mL）；D为葛根总多糖/总黄酮的稀释倍数；m 为葛根原料质量（g）。

2.4 星点设计-响应面法优选微乳提取工艺

2.4.1 单因素考察 根据预实验结果，影响葛根总黄酮和总多糖提取率的主要因素有溶剂物料比、超声提取时间和超声提取功率。溶剂物料比采用4、6、8 倍3 个水平，超声提取时间采用40、60、80 min 3 个水平，超声功率采用400、500、600 W 3个水平，以总黄酮和总多糖为指标，分别考察它们对提取效果的影响。结果显示，溶剂物料比达到6 倍时总多糖提取率增加减缓，总黄酮提取率有下降趋势，所以溶剂物料比选择4～8倍；当超声时间超过70 min时，总黄酮和总多糖提取率均不再增加，因而提取超声时间选择40～80 min；当超声功率为550 W 时，总黄酮提取率最高，而后不再增加，所以超声功率选择400～600 W。

2.4.2 星点实验设计 根据相关文献［11］和单因素实验结果，选取湖北葛根作为优选微乳提取工艺原料，将溶剂物料比A、提取时间B、提取功率C 3 个因素设为自变量，以总多糖提取率（%）和总黄酮提取率（%）为评价指标，得综合评分。根据星点设计原理，设计3 因素3 水平实验，水平代码及其代表的实验参数见表1，星点设计及结果见表2。

表1 设计实验因素与水平

表2 CCD响应面法优选微乳提取工艺实验设计及结果

2.4.3 结果分析 运用Design-Expert.V8.0.6软件将表2中的数据进行方程拟合分析，P＜0.0001，表示模型成立。方程为Y=9.58+0.24A+0.19B+0.17C+0.075AB+0.13AC+0.05BC-0.35A2-0.3B2-0.7C2，R2=0.9332，同时绘制不同溶剂物料比、提取时间和提取功率不同组合的效应面曲线和3D图。可见，二次多项式回归模型拟合程度及可信度高，可以进行微乳提取葛根总黄酮和总多糖工艺的预测。对葛根总黄酮和总多糖提取率Y 影响较大的是溶剂物料比A，葛根总黄酮和总多糖提取率随溶剂物料比的增加而降低，其次是提取时间和提取功率对葛根总黄酮和总多糖也有影响。见表3图1。

图1 不同溶剂物料比、提取时间和提取功率不同组合的效用面曲线和3D图

表3 葛根总多糖和总黄酮提取率二次多项式回归模型的方差分析

经过计算分析，综合葛根总黄酮和总多糖含量测定等结果，微乳提取的最佳工艺条件为：溶剂物料比6.84 倍，提取时间67.79 min，提取功率517.45 W。考虑实际情况微乳提取的最佳工艺条件定为：溶剂物料比6.8 倍，提取时间68 min，提取功率520 W。

2.5 验证试验按照“2.4”项下微乳制备和微乳超声提取的最优工艺平行制备3 份湖北葛根微乳提取物进行验证试验，与葛根总黄酮和总多糖提取率预测值4.98%和8.78%相比，验证试验葛根总黄酮平均提取率为4.40%，RSD 为0.11%；葛根总多糖提取率为8.50%，RSD 为0.12%，表明筛选的微乳超声提取工艺条件稳定可行。

2.6 不同产地葛根微乳提取的多糖和黄酮提取率测定根据“2.4”项下优化的微乳提取工艺，提取湖南、陕西、湖北、山西4 个不同产地葛根微乳中葛根总黄酮和葛根总多糖，根据“2.3”项下提取率计算公式，计算各产地葛根总多糖和总黄酮的提取率，结果显示湖北地区葛根总多糖和总黄酮提取率最高，多糖为8.50%，总黄酮为4.40%。见表4。

表4 不同产地葛根总黄酮和总多糖提取率 %

2.7 不同产地葛根微乳提取物对链脲佐菌素T2DM小鼠血糖的影响[12]

2.7.1 造模 SPF 级ICR 小鼠购买于北京斯贝福实验动物有限公司，雄性，5周龄，体质量（20±2）g，实验动物合格证号：SCXK9（京）2019-0003，实验动物喂养环境：SPF 级动物房，自由饮水，相对湿度：40%～70%，室温：20～26 ℃。实验由北京市怀柔区中医医院实验动物伦理审查委员会审查通过。取上述SPF 级ICR 雄性小鼠70 只，适应性饲养1周，依据随机数字表法分为正常对照组10 只，模型组60只。造模前所有小鼠禁食12 h，模型组小鼠腹腔注射2 mL 的STZ（60 mg/kg），正常对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水，连续注射5 天，造模期间小鼠自由饮食。于第5 天注射完STZ 后取小鼠尾部静脉血滴于血糖测定试纸，再将试纸插入血糖仪，测定小鼠非空腹血糖，若血糖值大于16.5 mmol/L 认为造模成功［13］。STZ 溶液配制完成后需在30 min内完成所有小鼠注射。

2.7.2 动物分组与给药 保留正常对照组10 只小鼠，将造模成功的60只小鼠随机分为模型对照组、二甲双胍组及湖南、陕西、湖北、山西葛根组各10只。根据药典标准，二甲双胍组小鼠以200 mg/（kg·d）灌胃给药，将二甲双胍配制成1 mg/mL 液体，不同产地葛根组将微乳提取液浓缩后按小鼠体质量每次0.5 mL/10 g 灌胃给药（日给药量相当于成年人日用量的15 g 葛根原药材），模型对照组灌胃等量生理盐水，所有小鼠每天灌胃4 次，连续14天，所有灌胃操作时间固定。

2.7.3 检测指标 1）一般情况：观察记录小鼠外观、精神状态和大小便等情况；2）血糖：给药第0、4、8、14 天检测小鼠血糖；3）体质量：实验第1、2、4、6、8、10、12、14 天记录小鼠体质量；4）进食量：建模成功前1 天，建模成功后第2、4、6、8、10、12、14 天灌胃给药前，称量每组小鼠所剩饲料重量，并补足等量饲料。每只小鼠进食量=（前一天补足后饲料重量-当天补足饲料前重量）/每笼小鼠数。

2.7.4 统计学方法 用SAS 8.0 软件分析数据，计量资料以表示，采用方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.7.5 结果

2.7.5.1 一般状况 模型对照组小鼠精神萎靡，尿量增加，毛竖立无光泽，其余各组小鼠外观正常，精神和大小便正常。

2.7.5.2 血糖 正常对照组小鼠非空腹血糖平均值为7.54 mmol/L，模型对照组小鼠腹腔注射STZ 结束后小鼠非空腹血糖值高于21.2 mmol/L，高于正常对照组（P＜0.01），说明造模成功。各组小鼠连续给药15 天，正常对照组小鼠血糖平均值为7.21 mmol/L，模型对照组小鼠血糖平均值为28.87 mmol/L，与给药第0 天相比增加了13.88%。与模型对照组比较，二甲双胍组和不同产地葛根组小鼠血糖值呈现不同程度下降趋势，不同产地中湖北地区葛根微乳提取物组小鼠血糖值下降最显著（P＜0.01）。表明T2DM 小鼠在不接受任何治疗的情况下，血糖升高，而湖北葛根组可在一定程度上缓解小鼠糖尿病症状。见图2。

图2 不同产地葛根微乳提取物对小鼠非空腹血糖值的影响

2.7.5.3 小鼠进食量 各组小鼠进食量逐渐增加，与正常对照组小鼠相比，模型对照组小鼠进食量增加（P＜0.01）。与模型对照组比较，除湖南葛根组外，山西、湖北、陕西葛根组及二甲双胍组有降低进食量作用趋势（P＜0.05）。其中湖北葛根组降低进食量的效果最显著，故不同产地微乳超声提取的葛根可在一定程度上缓解糖尿病相关症状，其中湖北葛根组控制小鼠进食量效果最好。见图3。

图3 不同产地葛根微乳提取物对小鼠进食量的影响

2.7.5.4 体质量 正常对照组小鼠体质量与实验时间成正比，实验结束时正常对照组小鼠体质量较实验前增加2.7%（P＜0.05）。其余6 组小鼠在实验第6 天左右体质量最大，之后随着实验的进行，小鼠体质量开始下降。实验结束时，模型对照组小鼠体质量为正常对照组的68.24%（P＜0.01）。二甲双胍组及湖南、山西、湖北、陕西葛根组均能不同程度缓解糖尿病小鼠体质量的降低，但是不同葛根组对小鼠体质量降低的缓解能力较二甲双胍组差，其中湖北葛根组缓解体质量降低能力较其他葛根组稳定。见图4。

图4 不同产地葛根微乳提取物对小鼠体质量的影响

3 讨论

微乳提取葛根，可以同时提取葛根中的多糖类成分和黄酮类成分。微乳中的表面活性剂和助表面活性剂成分可以不同程度提高体系的乳化程度，可以稳定水介质中的油相液滴。微乳液作为具有低粘度的光学透明体，与常规制剂相比，微乳液具有良好的稳定性、易制性、两亲性等优点。本研究依据微乳特点，通过微乳高效率提取葛根总黄酮和总多糖，符合环保、高效、安全需求。

T2DM 形成的最主要因素是饮食热量高，运动较少及年龄增加，在造模第5 天，小鼠非空腹血糖上升且大于20 mmol/L，表明糖尿病小鼠模型建造成功。糖尿病患者具有多饮、多食、多尿和体质量减少的特点。中医认为糖尿病属“消渴病”范围，而葛根具有“生津止渴”作用，用于治疗“消渴病”历史悠久［14-15］。袁媛等［16］研究表明，葛根中的葛根素对糖尿病小鼠有降血糖作用，可改善口服糖耐量，抑制糖化血红蛋白，抑制体内外晚期糖基化终末产物的形成。临床使用中发现，不同产地葛根降血糖作用不同。本实验结果显示不同产地葛根提取物能在一定程度上降低血糖，以湖北地区产葛根最显著，为临床使用葛根提供参考依据。