海洋生物胶原肽的制备及其皮肤保护活性研究进展

崔路路，陈 贝，乔 琨，王联珠，刘智禹

(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.福建水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013；3.中国水产科学院黄海水产研究所，山东 青岛 266071)

胶原蛋白是动物体细胞外基质中含量最多的蛋白之一，约占动物总蛋白的30%，其来源丰富，市售胶原蛋白通常从牛皮和猪皮中提取获得[1].由于近几十年牛海绵状脑病、传染性海绵状脑病和口蹄疫等陆地生物疾病的爆发，以及宗教壁垒等因素限制了陆地生物胶原蛋白及其制品的使用，造成胶原蛋白原料供给不稳定[2].海洋生物胶原蛋白可规避这些问题，并且具有良好的生物安全性、稳定性以及生物相溶性，故近几年胶原蛋白的来源逐渐转向了资源丰富的海洋.

海洋生物胶原肽是海洋生物胶原蛋白通过水解衍生而来的具有多种生物活性的肽类，具有分子质量小、易于吸收、生物利用率较高等特点[3]，故在功能性食品、美容护肤品以及生物医药制品等领域得到了广泛的应用.本文详细阐述了海洋生物胶原肽的皮肤保护功能活性、吸收代谢及安全性研究，揭示了海洋生物胶原肽在化妆品领域的广泛应用前景，为海洋功能化妆品的研究和应用提供理论依据.

1 海洋生物胶原肽概述

胶原蛋白是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白，构成了细胞外基质的骨架.它在细胞外基质中形成半晶体的纤维，参与了复杂的糖胺聚糖蛋白质网状结构，给细胞提供抗张力和弹性，并在细胞的迁移和发育中起重要作用.胶原蛋白是由3个螺旋多肽链结构组成，每条多肽链都含有1个或多个Gly-X-Y氨基酸序列，其中X是代表脯氨酸(Pro)或羟脯氨酸(Hyp)，Y代表任何氨基酸，它的分子质量大约为300 ku[2，4-5].

海洋生物胶原蛋白一般存在于海洋动物的皮肤、鳞片和骨骼的结缔组织中，其来源大致可以分为2类：一类是来源于海洋脊椎动物，如鱼类[6]；另一类是来源于海洋无脊椎动物，如水母[7]、海参[8]、海胆[9]等.目前发现海洋生物中胶原蛋白类型有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅺ型等，其中Ⅰ型最为常见，主要分布于海洋生物的皮肤、软骨等部位，其余类型的胶原蛋白较少(表1).

表1 不同海洋生物所含胶原蛋白的类型Tab.1 Types of collagen in different marine source

海洋生物胶原蛋白常用的提取方法主要有酸法提取、酶法提取和酸-酶复合提取等.单独利用酸法和酶法提取胶原蛋白产量较低,蛋白酶可水解胶原蛋白末端肽,含三螺旋结构的主体部分由于可溶于有机酸被提取出来,进一步提高胶原蛋白的提取效率.在实际操作中,大多数采用酸-酶复合法提取胶原蛋白,使用较多的是醋酸和胃蛋白酶,分别获得酸溶性胶原蛋白(acid-soluble collagen，ASC)和酶溶性胶原蛋白(pepsin-soluble collagen，PSC).具体操作步骤如图1所示.提取胶原蛋白之前，需经前处理去除鱼皮等原料中的杂质、非胶原蛋白和脂质物质，并将其冷冻干燥.将原料以一定的比例加入醋酸溶液中，在低温的条件下搅拌、离心，得到的沉淀用同样的条件再处理一次，合并两次的上清液，收集沉淀物.上清液用于获得ASC，沉淀物用于获得PSC[17-19].

表2列举了若干海洋生物胶原蛋白的提取方法及提取率.从提取率上看，大部分研究表明海洋生物PSC得率高于ASC，也有少量研究显示ASC得率高于PSC，例如蓝点马鲛[20]、霞水母[21]、鱿鱼[19]和平鳍旗鱼鱼皮胶原蛋白[22]等.ASC与PSC的得率可能归因于海洋生物种类和制备方法的差异.ASC和PSC的氨基酸组成结构相似，2种胶原蛋白均以甘氨酸为主要氨基酸，其次为羟脯氨酸、脯氨酸和丙氨酸[19].电泳分析显示海洋生物ASC和PSC均含有α1、α2、β和γ等主要条带，其中γ是α链的三聚体，β是α链的二聚体.从粘度上看，ASC粘度高于PSC[16，23-25]，这是由于酸法提取过程中保留了胶原分子的端肽成分，使得胶原分子内缠结增多，胶原溶液的粘度增高.通过扫描电镜观察海洋生物胶原蛋白结构特征表明，ASC和PSC通常在孔径大小、孔隙率、互连性和表面积等方面具有不同的微观结构，这使得ASC和PSC可应用至不同生物材料领域[18，22].

图1 海洋生物ASC和PSC的提取方法Fig.1 Extraction of ASC and PSC from marine source

表2 不同海洋生物中胶原蛋白的提取方法及提取率Tab.2 Extraction methods and yield of collagen from different marine source

海洋生物胶原肽是海洋生物胶原蛋白经水解衍生而来的具有多种生物活性的肽类，在许多相关研究中也称为胶原水解产物.与胶原蛋白相比，胶原肽具有分子质量小、易于吸收、生物利用率较高等特点.目前海洋生物胶原肽的提取方法主要有酸法、碱法、酶法、水热抽提、热压浸提、中性盐提取、微生物发酵法等，其中最常用的是酶法提取.表3列举了海洋生物胶原肽的提取方法及其优缺点[29-32].

表3 海洋生物胶原肽的提取方法及其优缺点Tab.3 Extraction method of marine collagen and its advantages and disadvantages

2 海洋生物胶原肽的皮肤保护功效

2.1 抗氧化活性

同时在细胞或动物水平也证实了海洋生物胶原肽的抗氧化活性，如Pozzolini等[39]发现纯化后的海绵胶原蛋白水解物具有抗氧化活性，清除ROS的能力为23%～60%，并且无毒性，故可以用于化妆品行业中.质量浓度为0.2 mg·mL-1条纹斑竹鲨鱼皮肽和质量浓度为1 mg·mL-1遮目鱼鱼鳞胶原肽显著降低H2O2损伤的HaCAT细胞内ROS水平，细胞内ROS水平分别达到对照组的50.9%和12.0%[40-41].红鲷鱼鳞胶原蛋白水解物可以降低丙二醛(MDA)的水平，质量浓度分别为1、3、6 mg·mL-1时，MDA的水平分别降低了13.4%、33.3%和36.9%，同时超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的水平有所增加，从而达到抗氧化的效果[42].鲍鱼肽ATPGDEG具有清除UVB(ultraviolet radiation B)诱导的HaCAT细胞内ROS的水平，抑制由UVB造成的细胞DNA损伤[43].

2.2 美白活性

黑色素是存在于皮肤中的天然色素，黑色素的增加可保护皮肤免受UV的侵害，但是黑色素的过量生成和堆积会引发黑斑、黄褐斑、雀斑及恶性黑色素瘤等皮肤问题.黑色素的形成过程与酪氨酸酶(TYR)、二羟基吲哚羧酸氧化酶(TRP-1)以及多巴色素异构酶(TRP-2)密切相关[44].

国内外已有研究证明海洋生物胶原肽可通过抑制酪氨酸酶活性减少黑色素的生成.如鱿鱼鱼皮胶原蛋白水解物可以抑制酪氨酸酶的活性，1 mg·mL-1的F3组分(3～10 ku)对酪氨酸酶的抑制率为39.65%[45].经分子筛柱层析分离纯化后的文蛤肽Mer1对酪氨酸酶有较强的抑制作用，从而降低黑色素的含量达到美白的效果[46].遮目鱼鱼鳞肽通过抑制酪氨酸酶的活性抑制黑色素的产生[47].分子质量在3～10 ku范围内的鱿鱼鱼皮胶原肽具有抑制酪氨酸活性的作用，当质量浓度为1 mg·mL-1时，对酪氨酸酶的抑制率为39.65%[45].

2.3 减少皮肤胶原蛋白流失

胶原蛋白是构成人体皮肤的主要成分，随着时间的推移以及外部环境的影响，胶原蛋白强度和厚度下降成为皮肤老化的主要因素.

Hyp是胶原蛋白的标志性氨基酸，Hyp含量降低是老化皮肤的主要标志之一.研究证明海洋生物胶原肽可以显著增加Hyp的含量，从而促进皮肤胶原蛋白的合成.Fan等[48]发现水母伞胶原肽处理经UV照射的小鼠，其皮肤中Hyp和胶原蛋白的含量明显增加.在海洋胶原肽抵抗胶原蛋白流失的作用机制研究方面，国内外已有研究表明海洋胶原肽可以通过一系列信号通路激活皮肤胶原蛋白合成或抑制皮肤胶原蛋白降解，如太平洋鳕鱼鱼皮明胶水解物可通过上调转化生长因子-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)和下调Smad7水平促进Ⅰ型前胶原的合成[49].鲑鱼皮胶原肽可以通过激活Smad信号通路，上调TGF-βRⅡ的表达，促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA的表达，降低MMP-1(matrix metalloproteinases-1)的表达和增加TIMPs(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases)的表达抑制皮肤胶原的降解，延缓皮肤的衰老[50].Wei等[51]从马氏珠母贝提取胶原肽，经过凝胶色谱和反向高效液相纯化得到的二肽PH可以降低由UVB诱导的HaCAT细胞中MMP-1和MMP-3的含量，从而降低胶原蛋白的降解，缓解衰老.从鳕鱼鱼皮中提取的胶原肽GEIGPSGGRGKPGKDGDAGPK和GFSGLDGAKGD，通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路相关蛋白磷酸化的表达降低MMP-1的含量[52].鲍鱼肽ATPGDEG抑制UVB诱导的HaCAT细胞内MMP-1和MMP-9的活性，通过下调MAPK信号通路中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)蛋白的磷酸化抑制Ⅰ型前胶原蛋白的降解[43].

2.4 抗炎活性

皮肤的脱皮、发红、瘙痒、痤疮等问题大多可归因于皮肤炎症.炎症是人体的防御反应，通常情况下是有益的，但如果炎症长期持续发生，将会导致皮肤状况的恶化和皮肤屏障的破坏.皮肤炎症发生时，毛细血管扩张，通透性增加，炎症细胞和炎症因子浸润.

海洋胶原肽具有良好的皮肤抗炎活性.如鲑鱼胸鳍肽可以抑制NO(nitric oxide)的合成，降低促炎细胞因子的产生，达到抗炎作用[53].皮肤经UV照射后，白介素-1α(interleukin 1α，IL-1α)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的水平显著提高，Chen等[49]研究了太平洋鳕鱼鱼皮胶原肽(CH)对光老化皮肤促炎细胞因子表达的影响，结果显示CH可以降低IL-1α和TNF-α的水平，降低皮肤炎症的发生，这和Ahn等[53]的研究结果类似，发现鲑鱼胸鳍胶原三肽抑制NO和前列腺素-E2(prostaglandin E2，PGE2)的表达，抑制率分别为63.80%和45.33%，同时显著降低促炎细胞因子(TNF-α，IL-6，IL-1β)的产生.

2.5 促进伤口愈合能力以及组织修复功能

海洋生物胶原蛋白及其水解物处理UV暴露的皮肤损伤具有良好的修复功效.研究人员通过体外细胞实验，发现海绵胶原蛋白水解物对UV照射后损伤的成纤维细胞和角化细胞具有伤口愈合能力和组织修复功能[39]，海蜇和鳕鱼皮多肽会提高细胞胶原蛋白和透明质酸的含量，对损伤细胞有修复作用[54].Chen等[55]通过小鼠实验发现三文鱼明胶及其水解物对UV引起的皮肤损伤有修复作用.水母伞胶原肽可以修复损伤皮肤中内源性胶原和弹性蛋白纤维[48].光裸星虫胶原肽处理皮层受伤的小鼠，发现该肽具有修复伤口愈合能力[56].

3 海洋生物胶原肽吸收代谢及安生性研究

研究表明摄入胶原肽可有效改善人体皮肤状况，增加皮肤水分，改善皮肤弹性和真皮胶原蛋白的结构，减缓受试女性的黄褐斑[57-59].口服胶原肽后体内吸收代谢研究对阐明其皮肤改善作用机制具有重要的意义.目前，口服海洋源胶原肽后体内吸收代谢研究相对较少.一项临床实验研究表明，志愿者通过口服深海鱼皮胶原肽后血液中的Hyp含量显著升高[57].大部分胶原肽体内吸收代谢的研究主要集中于陆生动物和淡水鱼源胶原肽.研究表明摄入陆生动物胶原多肽可在体内被吸收进入人体循环系统.如牛骨胶原多肽水解产物经口服摄入后，血液中胶原性肽的水平显著升高[60].小鼠摄入猪皮胶原水解物后，发现皮肤中Pro-Hyp含量升高，血液中Gly-Pro-Hyp含量升高，根据Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp的浓度最大时所需要的时间得出皮肤中Pro-Hyp是由血液中Gly-Pro-Hyp水解而来[61].小鼠口服鱼类胶原或胶原肽后，在血液和皮肤中可检测到胶原肽片段.例如研究人员利用14C标记的鲢鱼皮胶原蛋白来确定小鼠的代谢过程，在皮肤成纤维细胞中检测到含有Hyp的肽，这表明胶原肽在体内到达了皮肤靶细胞[62].小鼠口服鱼鳞胶原肽后，发现其血液中的Gly-Pro和Pro-Hyp的含量显著增加[63].目前未检索到海洋生物胶原肽与陆地生物胶原肽摄入机体后的代谢差异报道，针对该问题仍需进一步地探索研究.

目前已通过细胞、动物等不同水平实验证明海洋生物胶原肽毒副作用小的特性.在细胞水平，质量浓度为10 μg·mL-1和50 μg·mL-1的海绵胶原肽对L929成纤维细胞和HaCAT角质化细胞无毒性并显著促进细胞的增长[39].质量浓度在0.25～20 μg·mL-1的范围内，分子质量低于30 ku的海蜇胶原对人表皮角质形成细胞(HEKa)没有毒性，而分子质量高于30 ku的海蜇胶原在质量浓度大于1 μg·mL-1对HEKa有毒性[64]；质量分数为18%的鲑鱼鱼皮胶原多肽灌胃小鼠，没有慢性毒性的风险[65].质量浓度高达0.5 g·mL-1的双斑东方鲀鱼皮胶原肽经过多次皮肤刺激和急性眼刺激的实验，结果表明胶原肽对兔眼和皮肤均没有刺激性[27].

4 总结与展望

海洋生物胶原肽具有良好的抗氧化、美白、抗炎、促进组织修复等皮肤保护功效，在外用和口服化妆品领域均有巨大的应用前景.目前大多数海洋源胶原肽仍处于实验研发阶段，仍存在分子质量超过皮肤理想截留分子质量、油水分配系数较低、皮肤渗透性差、口服吸收代谢规律研究不够深入等问题.

未来充分探究海洋胶原肽皮肤渗透吸收特性及稳定性，克服皮肤屏障，安全有效地将肽类分子运送至皮肤靶细胞，明确口服后吸收、代谢、分布、排泄规律，是海洋胶原肽化妆品研究领域研发的重点和难点.海洋生物胶原肽化妆品的商业化对实现海洋生物加工副产物的深度开发利用，提升经济附加值及构建现代化海洋产业链均具有积极的意义.