急性心肌梗死患者血清miR-133a、miR-499-5p表达与PCI术后冠状动脉无复流的关系*

余 琴,梁丽艳,刘超群,方志敏,若 扎

新疆医科大学第二附属医院心血管内科,新疆乌鲁木齐 830063

经皮冠状动脉介入(PCI)是治疗急性心肌梗死(AMI)的重要手段,可短时间内开通闭塞血管,恢复缺血心肌的血流供应,挽救患者生命[1]。但部分AMI患者PCI术后易发生冠状动脉(冠脉)无复流现象,导致心肌无有效的血流灌注,降低PCI获益程度[2]。因此,寻找与AMI患者PCI术后冠脉无复流有关的指标,可为PCI术后冠脉无复流的防治提供参考。微小核糖核酸(miR)-133a为心源性miRNAs,不仅在心血管系统发育中发挥作用,也参与了心肌损伤的病理过程[3]。miR-499-5p在心肌细胞分化过程中起到重要作用,并通过多种信号通路影响心肌细胞内特异性基因表达,进一步损伤心肌[4]。结合miR-133a、miR-499-5p的作用机制,推测二者可能与AMI患者PCI术后冠脉血流恢复有关。鉴于此,本研究就血清miR-133a、miR-499-5p表达与急性心肌梗死患者介入术后冠脉无复流的关系分析如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 采用前瞻性队列研究,选取2019年2月至2021年10月本院收治的290例AMI患者作为研究对象。所有患者及家属均签署知情同意书。纳入标准:(1)符合《内科学(第9版)》[5]中AMI诊断标准,均为急性ST段抬高型心肌梗死;(2)发病时间<12 h。排除标准:(1)合并出血性疾病,如消化道出血、颅内出血等;(2)凝血功能障碍或血液系统疾病;(3)靶血管直径<2.25 mm;(4)合并严重脑血管疾病、肝肾功能不全等;(5)血管严重钙化,病变血管无法充分扩张;(6)对造影剂过敏;(7)术后随访期间死亡。本研究经医学伦理委员会审批通过(伦审号:20190128014)。

1.2方法 (1)治疗方法:所有患者均接受急诊PCI术治疗,手术相关操作参照《中国经皮冠状动脉介入治疗指南(2016)》[7]中相关标准进行。术后积极控制血压、血糖等危险因素,口服抗凝药物治疗,如阿司匹林、氯吡格雷等,连续治疗并随访3个月。(2)实验室指标检测。PCI术前使用乙二胺四乙酸盐抗凝管采集患者空腹静脉血12 mL。①取5 mL血液标本,使用PE-7200型血细胞分析仪(深圳市普康电子)测定白细胞计数(WBC)。②另取2 mL血液标本,自然沉淀2 h后,以1 000×g离心10 min,留取血浆-80 ℃保存待检;采用ExC810型凝血分析仪(北京普利生仪器)测定血浆纤维蛋白原(FIB)。③另取3 mL血液标本,以1 500×g离心分离15 min,留取血清-80 ℃保存待检,使用CLS380M型生化分析仪(泰州泽成生物技术)测定血清总胆固醇(TG)、甘油三酯(TC);采用化学发光免疫法测定血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)。试剂盒购自湖南菲科生物技术公司。采用酶联免疫吸附试验测定心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)、脑钠肽(BNP);(3)miRNAs检测。取剩余血液标本2 mL,离心处理后,加入Trizol总RNA提取试剂750 μL、裂解液400 μL,以12 000×g离心15 min,取上清液400 μL,加入氯仿400 μL;再次12 000×g离心15 min,取上层无色水相600 μL,加入75%乙醇200 μL,8 000×g离心5 min弃吸附柱,取300 μL流出液,加入200 μL无水乙醇后,12 000×g离心30 s,弃流出液,留取吸附柱备用;随后洗脱吸附柱中蛋白,加入漂洗液600 μL,使其与吸附柱充分反应后,将吸附柱中除miRNA外的杂质洗脱,12 000×g离心1 min,加入无核酸酶水30 μL,12 000×g离心2 min,得到总RNA提取液。采用实时荧光定量PCR测定miR-133a、miR-499-5p相对表达水平。miR-133a:正向引物为5′-ATGGTTCGTGCGTTTGGTCCCCTTCA-3′,反向引物为5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′;miR-499-5p:正向引物为5′-CGTGTCGACCAAGTCTGGGGTGAA AGAGAAG-3′,反向引物为5′-TGTGTCGACGGTCATGAGCTTGTTGAGGTTC-3′;内参U6:正向引物为5′-CTCCCTTCGGCACCACA-3′,反向引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件:95 ℃变性2 min,94 ℃变性20 s,60 ℃退火、延伸34 s,共45个循环。采用2-ΔΔCt法计算相对表达水平。

1.3冠脉无复流的判定方法及分组 全部患者均接受为期3个月的随访,随访期间一旦患者出现胸痛、血压降低或复查心电图提示ST段抬高,立即行冠状动脉造影检查明确患者冠脉血流情况,并依据心肌梗死溶栓治疗(TIMI)分级[6]评估患者冠脉血流分级。0级:造影提示血管闭塞远端无血流;1级:造影提示闭塞部位可通过血流,但无法到达远端;2级:造影提示闭塞部位可通过血流并到达远端,但充盈速度慢;3级:造影提示闭塞部位可通过血流且快速到达血管远端。依据AMI患者PCI术后冠脉TIMI血流分级将患者分为无复流组与复流正常组,血流TIMI分级0～2级为冠脉无复流,TIMI分级3级为复流正常。

2 结 果

2.1AMI患者冠脉血流情况 随访3个月,290例AMI患者PCI术后TIMI分级1～2级66例(无复流组),3级224例(复流正常组),冠脉无复流发生率为22.76%(66/290)。无复流组发病至PCI时间长于复流正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。无复流组与复流正常组患者其他一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较或n(%)]

2.2两组实验室指标比较 无复流组患者术前WBC、CK-MB、cTnI、miR-133a、miR-499-5p表达水平高于复流正常组,差异有统计学意义(P<0.05);组间其他指标比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组实验室指标比较

2.3各因素影响AMI患者PCI术后冠脉无复流的回归分析 将AMI患者PCI术后冠脉无复流情况作为因变量(0=复流正常,1=无复流),将结果2.2、2.3中差异有统计学意义的变量纳入作为自变量(均为连续变量),行Logistic回归分析,结果显示,发病至PCI时间长,以及术前WBC、CK-MB、cTnI、miR-133a、miR-499-5p高均是AMI患者PCI术后血流TIMI分级低的危险因素(OR>1,P<0.05)。见表3。

表3 各因素影响AMI患者PCI术后冠脉无复流的Logistic回归分析

2.4血清miR-133a、miR-499-5p对AMI患者PCI术后冠脉无复流的预测价值 将术前血清miR-133a、miR-499-5p作为检验变量,将AMI患者PCI术后冠脉复流情况作为状态变量(赋值:1=无复流,0=复流正常),绘制ROC曲线,结果显示,术前血清miR-133a、miR-499-5p及二者联合预测AMI患者PCI术后冠脉无复流的AUC为 0.727、0.697、0.773,具有一定的预测价值。见表4、图1。

表4 血清miR-133a、miR-499-5p对AMI患者PCI术后冠脉无复流的预测价值

图1 血清miR-133a、miR-499-5p预测AMI患者PCI术后冠脉无复流的ROC曲线

2.5血清miR-133a、miR-499-5p预测AMI患者PCI术后冠脉无复流的决策曲线 以净收益率为纵坐标,高风险阈值为横坐标,绘制决策曲线,结果显示,在阈值0.09～0.40、0.43～1.00范围内,血清miR-133a、miR-499-5p联合预测AMI患者PCI术后冠脉无复流的净收益率优于单独的净收益率;且在高风险阈值0.00～1.00范围内血清miR-133a、miR-499-5p联合预测AMI患者PCI术后冠脉无复流的净收益率>0,提示有临床意义。见图2。

图2 血清miR-133a、miR-499-5p预测AMI患者PCI术后冠脉无复流的决策曲线

3 讨 论

冠脉无复流是PCI术后常见的并发症之一,主要是由于血管内皮细胞损伤、再灌注损伤、微血管痉挛等多种病理改变所致,严重可导致室颤、心室停搏等,增加AMI患者病死风险[8]。本研究中290例AMI患者PCI术后3个月冠脉无复流发生率为22.76%,与杨飞等[9]研究结果(22.33%)相近,提示AMI患者PCI术后冠脉无复流发生风险高。因此,寻找与AMI患者PCI术后有关的指标对术后冠脉无复流进行预测,从而早期采取预防、治疗措施尤为重要。

本研究结果显示,发病至PCI时间长,以及术前WBC、CK-MB、cTnI高是AMI患者PCI术后血流TIMI分级低的危险因素。发病至PCI时间越长通常提示AMI患者心肌缺血时间越长,心肌损伤程度越严重,心肌组织的微循环结构损伤越重,容易引起PCI术后心肌低灌注或无灌注,导致冠脉无复流的发生[10]。高WBC患者梗死部位易出现大量白细胞聚集,进而加重心肌损伤,并引起心肌组织的毛细血管阻塞,影响冠脉微循环的血流,导致无复流的发生[11]。CK-MB、cTnI是临床常见的心肌损伤标志物,二者水平越高提示心肌损伤程度越重,微循环障碍越严重,AMI患者PCI术后越容易发生冠脉无复流[12]。MYO通常在AMI发病后2 h内升高,是AMI早期诊断的重要标志物,但本研究中两组MYO差异无统计学意义(P>0.05),考虑主要原因是病例来源单一,样本量较小。以上指标虽然与AMI患者PCI术后冠脉无复流现象有关,但临床仍缺乏对PCI术后冠脉无复流现象的针对性治疗,因此寻找新的客观指标,预测评估AMI患者PCI术后冠脉无复流的发生,或可为AMI新的治疗方案提供依据。

miR-133a包括多种核苷酸序列,分别定位于人类第18号与20号染色体上,可促进胚胎干细胞分化为成肌纤维细胞,并抑制成肌细胞分化为心肌细胞[13]。YAO等[14]研究证实,miR-133a表达与心房颤动、心肌纤维化有关。本研究发现,术前血清miR-133a水平越高,AMI患者PCI术后冠脉无复流风险越高。分析原因在于,高水平miR-133a可抑制结缔组织生长因子表达,促进心肌纤维化,加重心肌细胞损伤,进而影响AMI患者PCI术后心肌血流灌注,导致冠脉无复流现象的发生[15]。SI等[16]通过动物实验发现,circHipk3可通过结合miR-133a,促进结缔组织生长因子的表达,进一步激活内皮细胞,减轻大鼠心肌损伤。何亚磊等[17]研究发现,急性冠脉综合征患者血浆miR-133a表达显著高于健康对照者,且其表达水平与冠脉病变程度显著相关。本研究结果与上述研究一致。

此外,miR-499-5p的表达与冠状动脉粥样硬化及多种心血管疾病密切相关[18]。本研究结果显示,术前miR-499-5p水平越高,AMI患者PCI术后冠脉无复流风险越高。miR-499-5p过表达会靶向调控CACNβ1的表达,进而影响心肌细胞的L-钙电流,加重心肌损伤,影响PCI术后心肌血流灌注[19]。miR-499-5p高表达还能改变miRNA的靶向性,加重AMI患者PCI术后心肌组织应激反应,引起超负荷的心肌压力,进而损伤心肌细胞,影响术后冠脉血流灌注,导致冠脉无复流的发生[20]。miR-499-5p高表达还能通过调控SOX6蛋白,引起血管内皮细胞的炎症反应,导致AMI患者PCI术后发生血管炎症损伤,影响血管功能,进而导致冠脉无复流的发生[21]。

ROC曲线、决策曲线分析结果显示,术前血清miR-133a、miR-499-5p对AMI患者PCI术后冠脉无复流具有一定的预测价值;在高风险阈值0.00～1.00范围内血清miR-133a、miR-499-5p联合预测AMI患者PCI术后冠脉无复流的净收益率>0,提示有临床意义。进一步说明miR-133a、miR-499-5p可作为AMI患者PCI术后冠脉无复流的预测因子。因此,临床可早期对拟行PCI术的AMI患者进行miR-133a、miR-499-5p检测,对术后冠脉血流灌注恢复程度进行预测评估,尤其对miR-133a、miR-499-5p表达异常的患者,应早期采取相应的治疗措施,如环化腺苷酸、能量合剂、肌苷等保护心肌药物,减轻AMI患者心肌损伤,降低患者PCI术后冠脉无复流的发生风险。

综上所述,血清miR-133a、miR-499-5p水平与AMI患者PCI术后冠脉无复流现象有关,可作为PCI术后冠脉无复流的预测因子,为AMI患者PCI术后冠脉无复流的预防、治疗提供新的思路。但本研究也存在局限,如纳入患者仅为急性ST段抬高型心肌梗死患者,随访时间较短,未进行长期随访跟踪,且为单中心研究,纳入样本量相对较小,未来仍需要扩大研究范围、延长研究时间,进行多中心大样本量的研究对研究结论进行进一步验证。