胃肠间质瘤不同中医证型的免疫组化因子表达及临床意义

罗教秀 储 兵 孟凤娇 林绮璐

广东省中山市人民医院病理科，广东中山 528403

胃肠间质瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST）是常见的间叶源性肿瘤，其在胃肠道恶性肿瘤中占1%～3%，好发于50～70岁人群[1]。其预后通常与危险程度分级、病例分期、肿瘤直径等因素有关，近年来，人们对GIST的关注日渐提高，该疾病的诊断、治疗、新药研发等均具有诸多进展[2]。C-kit原癌基因蛋白 117（C-kit proto-oncogene protein，CD117）、CD34是诊断GIST指标中具有较高诊断价值的免疫组化标志物，抗原Ki-67是良、恶性肿瘤诊断、预后评估的指标[3]。对于GIST，我国传统医学中并无相关描述，而近年来有部分学者将GIST归类于传统医学“息肉”范畴。基于此，本研究对60例GIST患者CD117、CD34、Ki-67的表达情况进行分析，分析其与GIST患者中医证型的关系，旨在探讨中医不同证型之间客观指标的差异，分析其中医证型与相关免疫组化因子的关系，为临床中西医结合诊断、治疗GIST提供方向。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年2月至2021年10月于中山市人民医院（我院）就诊的胃肠道间质瘤患者60例作为研究对象。其中男29例，女31例，年龄27～81岁，平均（57.42±6.39）岁。纳入标准：①经病理学检测确诊为GIST；②符合《中医病证诊断疗效标准》[4]、《中医常见证诊断标准》[5]中息肉相关诊断依据；③手术获取的组织蜡片材料充足；④患者临床资料齐全；⑤患者均对本研究知情同意，并签署知情同意书。排除标准：①入组前均接受过放疗、化疗、手术切除以及中医药治疗等；②合并其他部位的肿瘤；③合并严重心、肺、肾等重要器官功能障碍；④存在精神疾病无法配合研究等。本研究已通过医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 主要设备、材料及操作方法 兔抗人CD117多克隆抗体、兔抗人CD34分子抗体、Ki-67细胞增殖检测试剂盒均购于上海长嘉生物科技有限公司；兔抗人Ki-67多克隆抗体、通用型两步法检测试剂盒、PBS磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液均购于上海长嘉生物科技有限公司；DAB免疫组织化学显色试剂盒购于上海长嘉生物科技有限公司；苏木素购自北京索莱宝科技有限公司、防脱玻片购于南通市甄选医疗科技有限公司、Roche Benchmark XT/ULTRA全自动多功能免疫组化检测系统仪（瑞士罗氏）、RM2245是半自动轮转式切片机（德国徕卡）、EG1160一体式石蜡包埋机（德国徕卡）；BX41光学显微镜（日本OLYMPUS）。操作步骤严格按照说明书进行：①切片。对石蜡包埋组织进行切片，切片厚度约为4 μm，每个切片3张，分为Ki-67组、CD34组、CD117组。②脱蜡。将切片浸泡在二甲苯中，每次浸泡30 min，重复2次；再放在无水乙醇中浸泡5 min，重复2次；放在95%乙醇中浸泡5 min，2次；置于浓度80%乙醇中浸泡5 min；置于75%乙醇中浸泡5 min，最后用蒸馏水冲洗5 min。③抗原修复。将切片浸泡在pH值为8的EDTA抗原修复液中，修复3 min以保持切片湿润。用磷酸盐缓冲液洗涤3次切片，每次3 min。④抗原修复与暴露切片。切片放在柠檬酸缓冲液中浸泡后，置于微波炉内进行加热以修复抗原，时间12 min。随后取出切片在室温内冷却，并用磷酸盐缓冲液洗涤3次。⑤滴加抗体。在切片上滴加适量一抗，置于4℃环境中孵育过夜。取出并用磷酸盐缓冲液洗涤3次，在滴加相应的二抗，在室温37℃环境中孵育60 min，用磷酸盐缓冲液洗涤3次。⑥显色复染。在切片上滴加显色剂显色3～5 min后用蒸馏水冲洗，并在切片上滴加Mayer苏木精溶液复染1 min，水洗5 min，最后按照乙醇梯度法对切片进行脱水，并用中性树胶封片。

1.2.2 免疫组化染色结果判断标准 高倍显微镜下观察，存在棕色颗粒染色细胞为阳性细胞，免疫组化指标阳性表达率计算方法：选取免疫组化染色较强的区域10个进行细胞计数，共观察1000个细胞，阳性表达率=所观察阳性细胞总数/1000×100%。

1.3 观察指标及评价标准

观察组织标本免疫组化镜下CD117、CD34、Ki-67的表达情况；比较GIST患者不同临床特征及中医证型CD117、CD34、Ki-67阳性表达情况；采用Spearman相关系数检验不同中医证型GIST与CD117、CD34、Ki-67表达的相关性。

患者中医证型评估标准：术前，参考《中医常见证诊断标准》[5]对患者进行中医证型判断，患者中医证型主要分为湿热内阻、脾虚湿瘀、脾胃气虚三种。

1.4 统计学方法

本研究采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析，计数资料用[n（%）]表示，行χ2检验，计量资料以均数±标准差（）表示，行t检验，应用Spearman系数进行相关性分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测结果

纳入的60例GIST患者中，GIST组织CD117阳性率为90.00%（54/60）、CD34阳性率为81.67%（49/60）、Ki-67阳性率为 70.00%（42/60）。

2.2 GIST患者不同临床特征及中医证型CD117、CD34、Ki-67阳性表达情况比较

不同的年龄、性别、核分裂数患者CD117、CD34、Ki-67阳性表达率及不同肿瘤直径、危险程度患者CD117、CD34阳性表达率差异无统计学意义（P＞ 0.05）；不同肿瘤直径、危险程度患者Ki-67阳性表达率及不同中医证型患者CD117、CD34、Ki-67阳性表达率差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表1。

表1 GIST患者不同临床特征及中医证型CD117、CD34、Ki-67阳性表达情况比较[n（%）]

2.3 GIST中医证型与CD117、CD34、Ki-67阳性表达的相关性

经Spearman系数检验，GIST患者各中医证型比例分别与 CD117呈正相关（P＜ 0.05），与 CD34、Ki-67阳性表达呈负相关（P＜ 0.05）。见表2。

表2 GIST中医证型与CD117、CD34、Ki-67阳性表达的相关性

3 讨论

GIST是外国学者Clark和Mazur教授于1983年首次提出[6]，是一组起源于肠道内原始的多潜能肝细胞中的肿瘤，该肿瘤具有自身特征的形态学、遗传特性以及免疫表型等，其多向分化的特性，导致其在生物学上难以预估[7]。GIST在以往的报道中并不常见，其在胃肠道肿瘤中占比不到1%[8]，它们起源于位于肌肉层内的Cajal间质细胞，其特征在于酪氨酸激酶受体KIT的过表达[9]。未转移的GIST的标准治疗是手术切除，具有转移的GIST通常仅通过酪氨酸激酶抑制剂治疗而无法根治；因此，早期诊断是改善其预后的唯一方法。随着我国医学的发展，目前临床上中西医结合应用于GIST治疗中，但关于GIST的中医证型及患者临床特征、免疫组化因子等相关研究仍较为少见。基于此，本研究对60例GIST患者肿瘤组织CD117、CD34、Ki-67的表达情况及其中医证型情况进行探讨，旨在为中西医结合治疗GIST提供新思路。

本研究结果显示，CD117、CD34、Ki-67在GIST组织中均具有较高的阳性表达率，Ki-67的表达与患者预后有关。在GIST的发生，中心事件主要为C-kit原癌基因突变[9]，而CD117是C-kit的表达产物，是一种跨膜的酪氨酸激酶受体，是GIST常用的免疫组化指标，对GIST具有较高的诊断特异度，其在GIST中表达阳性率为90%以上，CD34是骨髓造血干细胞抗原，是一种糖基化跨膜蛋白，在GIST中阳性表达率为70%～89%，其特异度较CD117稍差[10]，与本研究结果一致。本研究中，不同肿瘤直径、危险程度患者Ki-67阳性表达率存在明显差异。Ki-67是一种分布在细胞核内，与增殖细胞相关的核抗原，其被认为与细胞分裂有关，可作为一种肿瘤良恶性、侵袭行为以及预后的标志性指标，同时也是细胞分裂和增殖活动的一种标志物[11-12]。相关研究报道，Ki-67的表达水平与GIST危险程度分级存在密切的相关性[13]，与本研究结果一致。相关研究[14]报道，CD117、CD34、Ki-67在虽然GIST组织中同样具有较高的阳性表达率，但其与患者预后无关。其中原因可能为GIST的发生与发展不是一个简单的过程，个体之间存在差异，因此还有待进一步的研究。

中医药历史悠久，在治疗胃肠功能障碍方面具有独特的优势[15]，而中医药在GIST的诊疗中必将会占一席之地。基于此，应尽早统一GIST在中医理论中所属范畴，总结其中医证型。然而，GIST在中医理论中并无相关论述，以往临床常以主证作为其病名，如GIST患者主诉胃脘隐痛，故有学者将其纳入“胃痛”范畴；若以反酸为主诉症状，则被纳入为“吐酸”范畴；若以胃脘胀满为主诉症状，则纳入“痞满”范畴；因此，并不利于临床对疾病的判断。而本研究中，依据《中医常见证诊断标准》[5]中相关证型描述，同时，林益群等[16]表明，GIST本质为脾虚，其还具有痰湿、血瘀、热度等证，初期患者多为湿热瘀实，久之则为正气虚，因此本研究中所纳入患者主要可分为脾胃气虚、脾虚湿瘀、湿热内阻三种证型。本研究中，对不同中医证型的GIST及其CD117、CD34、Ki-67的相关性分析结果显示，不同中医证型患者CD117、CD34、Ki-67阳性表达率存在相关性。由此可见，对GIST组织细胞CD117、CD34、Ki-67表达情况进行检测，或可对患者中医证型的鉴别与诊断具有一定的价值。但其中具体作用机制，仍需进一步深入研究。

综上所述，检测CD117、CD34、Ki-67的表达情况对GIST患者中医证型的诊断与鉴别具有重要意义，Ki-67阳性表达与肿瘤直径、危险程度有关，可作为评估GIST预后的一项指标。然而本研究中仅对GIST组织CD117、CD34、Ki-67三项指标进行了免疫组化检测，仅可将GIST组织区别于其他肿瘤组织或健康组织，并未对其量化检测；同时关于三项指标与患者中医证型相关性的机制尚未阐明，仍需进行更深入的研究。