胃肠间质瘤不同中医证型的免疫组化因子表达及临床意义

2023-04-11 03:03罗教秀孟凤娇林绮璐
中国医药科学 2023年5期
关键词:证型缓冲液切片

罗教秀 储 兵 孟凤娇 林绮璐

广东省中山市人民医院病理科,广东中山 528403

胃肠间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)是常见的间叶源性肿瘤,其在胃肠道恶性肿瘤中占1%~3%,好发于50~70岁人群[1]。其预后通常与危险程度分级、病例分期、肿瘤直径等因素有关,近年来,人们对GIST的关注日渐提高,该疾病的诊断、治疗、新药研发等均具有诸多进展[2]。C-kit原癌基因蛋白 117(C-kit proto-oncogene protein,CD117)、CD34是诊断GIST指标中具有较高诊断价值的免疫组化标志物,抗原Ki-67是良、恶性肿瘤诊断、预后评估的指标[3]。对于GIST,我国传统医学中并无相关描述,而近年来有部分学者将GIST归类于传统医学“息肉”范畴。基于此,本研究对60例GIST患者CD117、CD34、Ki-67的表达情况进行分析,分析其与GIST患者中医证型的关系,旨在探讨中医不同证型之间客观指标的差异,分析其中医证型与相关免疫组化因子的关系,为临床中西医结合诊断、治疗GIST提供方向。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年2月至2021年10月于中山市人民医院(我院)就诊的胃肠道间质瘤患者60例作为研究对象。其中男29例,女31例,年龄27~81岁,平均(57.42±6.39)岁。纳入标准:①经病理学检测确诊为GIST;②符合《中医病证诊断疗效标准》[4]、《中医常见证诊断标准》[5]中息肉相关诊断依据;③手术获取的组织蜡片材料充足;④患者临床资料齐全;⑤患者均对本研究知情同意,并签署知情同意书。排除标准:①入组前均接受过放疗、化疗、手术切除以及中医药治疗等;②合并其他部位的肿瘤;③合并严重心、肺、肾等重要器官功能障碍;④存在精神疾病无法配合研究等。本研究已通过医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 主要设备、材料及操作方法 兔抗人CD117多克隆抗体、兔抗人CD34分子抗体、Ki-67细胞增殖检测试剂盒均购于上海长嘉生物科技有限公司;兔抗人Ki-67多克隆抗体、通用型两步法检测试剂盒、PBS磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液均购于上海长嘉生物科技有限公司;DAB免疫组织化学显色试剂盒购于上海长嘉生物科技有限公司;苏木素购自北京索莱宝科技有限公司、防脱玻片购于南通市甄选医疗科技有限公司、Roche Benchmark XT/ULTRA全自动多功能免疫组化检测系统仪(瑞士罗氏)、RM2245是半自动轮转式切片机(德国徕卡)、EG1160一体式石蜡包埋机(德国徕卡);BX41光学显微镜(日本OLYMPUS)。操作步骤严格按照说明书进行:①切片。对石蜡包埋组织进行切片,切片厚度约为4 μm,每个切片3张,分为Ki-67组、CD34组、CD117组。②脱蜡。将切片浸泡在二甲苯中,每次浸泡30 min,重复2次;再放在无水乙醇中浸泡5 min,重复2次;放在95%乙醇中浸泡5 min,2次;置于浓度80%乙醇中浸泡5 min;置于75%乙醇中浸泡5 min,最后用蒸馏水冲洗5 min。③抗原修复。将切片浸泡在pH值为8的EDTA抗原修复液中,修复3 min以保持切片湿润。用磷酸盐缓冲液洗涤3次切片,每次3 min。④抗原修复与暴露切片。切片放在柠檬酸缓冲液中浸泡后,置于微波炉内进行加热以修复抗原,时间12 min。随后取出切片在室温内冷却,并用磷酸盐缓冲液洗涤3次。⑤滴加抗体。在切片上滴加适量一抗,置于4℃环境中孵育过夜。取出并用磷酸盐缓冲液洗涤3次,在滴加相应的二抗,在室温37℃环境中孵育60 min,用磷酸盐缓冲液洗涤3次。⑥显色复染。在切片上滴加显色剂显色3~5 min后用蒸馏水冲洗,并在切片上滴加Mayer苏木精溶液复染1 min,水洗5 min,最后按照乙醇梯度法对切片进行脱水,并用中性树胶封片。

1.2.2 免疫组化染色结果判断标准 高倍显微镜下观察,存在棕色颗粒染色细胞为阳性细胞,免疫组化指标阳性表达率计算方法:选取免疫组化染色较强的区域10个进行细胞计数,共观察1000个细胞,阳性表达率=所观察阳性细胞总数/1000×100%。

1.3 观察指标及评价标准

观察组织标本免疫组化镜下CD117、CD34、Ki-67的表达情况;比较GIST患者不同临床特征及中医证型CD117、CD34、Ki-67阳性表达情况;采用Spearman相关系数检验不同中医证型GIST与CD117、CD34、Ki-67表达的相关性。

患者中医证型评估标准:术前,参考《中医常见证诊断标准》[5]对患者进行中医证型判断,患者中医证型主要分为湿热内阻、脾虚湿瘀、脾胃气虚三种。

1.4 统计学方法

本研究采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析,计数资料用[n(%)]表示,行χ2检验,计量资料以均数±标准差()表示,行t检验,应用Spearman系数进行相关性分析,P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测结果

纳入的60例GIST患者中,GIST组织CD117阳性率为90.00%(54/60)、CD34阳性率为81.67%(49/60)、Ki-67阳性率为 70.00%(42/60)。

2.2 GIST患者不同临床特征及中医证型CD117、CD34、Ki-67阳性表达情况比较

不同的年龄、性别、核分裂数患者CD117、CD34、Ki-67阳性表达率及不同肿瘤直径、危险程度患者CD117、CD34阳性表达率差异无统计学意义(P> 0.05);不同肿瘤直径、危险程度患者Ki-67阳性表达率及不同中医证型患者CD117、CD34、Ki-67阳性表达率差异有统计学意义(P< 0.05)。见表1。

表1 GIST患者不同临床特征及中医证型CD117、CD34、Ki-67阳性表达情况比较[n(%)]

2.3 GIST中医证型与CD117、CD34、Ki-67阳性表达的相关性

经Spearman系数检验,GIST患者各中医证型比例分别与 CD117呈正相关(P< 0.05),与 CD34、Ki-67阳性表达呈负相关(P< 0.05)。见表2。

表2 GIST中医证型与CD117、CD34、Ki-67阳性表达的相关性

3 讨论

GIST是外国学者Clark和Mazur教授于1983年首次提出[6],是一组起源于肠道内原始的多潜能肝细胞中的肿瘤,该肿瘤具有自身特征的形态学、遗传特性以及免疫表型等,其多向分化的特性,导致其在生物学上难以预估[7]。GIST在以往的报道中并不常见,其在胃肠道肿瘤中占比不到1%[8],它们起源于位于肌肉层内的Cajal间质细胞,其特征在于酪氨酸激酶受体KIT的过表达[9]。未转移的GIST的标准治疗是手术切除,具有转移的GIST通常仅通过酪氨酸激酶抑制剂治疗而无法根治;因此,早期诊断是改善其预后的唯一方法。随着我国医学的发展,目前临床上中西医结合应用于GIST治疗中,但关于GIST的中医证型及患者临床特征、免疫组化因子等相关研究仍较为少见。基于此,本研究对60例GIST患者肿瘤组织CD117、CD34、Ki-67的表达情况及其中医证型情况进行探讨,旨在为中西医结合治疗GIST提供新思路。

本研究结果显示,CD117、CD34、Ki-67在GIST组织中均具有较高的阳性表达率,Ki-67的表达与患者预后有关。在GIST的发生,中心事件主要为C-kit原癌基因突变[9],而CD117是C-kit的表达产物,是一种跨膜的酪氨酸激酶受体,是GIST常用的免疫组化指标,对GIST具有较高的诊断特异度,其在GIST中表达阳性率为90%以上,CD34是骨髓造血干细胞抗原,是一种糖基化跨膜蛋白,在GIST中阳性表达率为70%~89%,其特异度较CD117稍差[10],与本研究结果一致。本研究中,不同肿瘤直径、危险程度患者Ki-67阳性表达率存在明显差异。Ki-67是一种分布在细胞核内,与增殖细胞相关的核抗原,其被认为与细胞分裂有关,可作为一种肿瘤良恶性、侵袭行为以及预后的标志性指标,同时也是细胞分裂和增殖活动的一种标志物[11-12]。相关研究报道,Ki-67的表达水平与GIST危险程度分级存在密切的相关性[13],与本研究结果一致。相关研究[14]报道,CD117、CD34、Ki-67在虽然GIST组织中同样具有较高的阳性表达率,但其与患者预后无关。其中原因可能为GIST的发生与发展不是一个简单的过程,个体之间存在差异,因此还有待进一步的研究。

中医药历史悠久,在治疗胃肠功能障碍方面具有独特的优势[15],而中医药在GIST的诊疗中必将会占一席之地。基于此,应尽早统一GIST在中医理论中所属范畴,总结其中医证型。然而,GIST在中医理论中并无相关论述,以往临床常以主证作为其病名,如GIST患者主诉胃脘隐痛,故有学者将其纳入“胃痛”范畴;若以反酸为主诉症状,则被纳入为“吐酸”范畴;若以胃脘胀满为主诉症状,则纳入“痞满”范畴;因此,并不利于临床对疾病的判断。而本研究中,依据《中医常见证诊断标准》[5]中相关证型描述,同时,林益群等[16]表明,GIST本质为脾虚,其还具有痰湿、血瘀、热度等证,初期患者多为湿热瘀实,久之则为正气虚,因此本研究中所纳入患者主要可分为脾胃气虚、脾虚湿瘀、湿热内阻三种证型。本研究中,对不同中医证型的GIST及其CD117、CD34、Ki-67的相关性分析结果显示,不同中医证型患者CD117、CD34、Ki-67阳性表达率存在相关性。由此可见,对GIST组织细胞CD117、CD34、Ki-67表达情况进行检测,或可对患者中医证型的鉴别与诊断具有一定的价值。但其中具体作用机制,仍需进一步深入研究。

综上所述,检测CD117、CD34、Ki-67的表达情况对GIST患者中医证型的诊断与鉴别具有重要意义,Ki-67阳性表达与肿瘤直径、危险程度有关,可作为评估GIST预后的一项指标。然而本研究中仅对GIST组织CD117、CD34、Ki-67三项指标进行了免疫组化检测,仅可将GIST组织区别于其他肿瘤组织或健康组织,并未对其量化检测;同时关于三项指标与患者中医证型相关性的机制尚未阐明,仍需进行更深入的研究。

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