不同粉碎粒度对人参败毒标准汤物理指纹图谱和多指标成分含量的影响

张利恒，陈 新，邱智东

长春中医药大学 长白山道地药材药效物质重点研究室，吉林 长春 130117

人参败毒散始载于《太平惠民和剂局方》，由羌活、独活、柴胡、川芎、桔梗、前胡、茯苓、枳壳、人参、甘草、生姜、薄荷组成[1-2]，此方兼顾正邪，可补不滞邪，祛邪不伤正，为治疗疫病的经典古方之一[3-4]。方中化学成分繁多复杂，主要有效成分为香豆素类、黄酮类、皂苷类等化合物。其中，香豆素类成分蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯具有较明显的抗炎、镇痛、平喘、抗病毒等药理作用[5]；黄酮苷类成分新橙皮苷、柚皮苷具有抗氧化、抗炎等药效作用[6-7]，甘草苷具有扩张外周血管、调节免疫功能等[8]；皂苷类成分柴胡皂苷a、b 具有抗炎、解热、抗病毒、增强免疫力的功效[9-10]。课题组参考了《中国药典》2020年版和相关文献报道[11-12]，进行前期研究，发现人参败毒散中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量较高且稳定。

物理指纹图谱法，可以直观反映中药方剂不同批次间各物理指标的相似及差异程度，同时能综合表征标准汤的物理属性，可用于中药方剂的质量评价[13]。在物理指标中，盐度（S）为液体中盐类物质的质量分数，是与药物吸收相关的影响因素；溶解性总固体（total dissolved solids，TDS）值反映了水溶液中所有固体物质的总量，具体指水中钾、钠、钙等矿物质离子和有机物等；电导率（G）、动力黏度（μ）的不同可导致制剂成型过程中产生差异[14]；电位（V）反映了溶液中所有物质的宏观氧化还原性，与药液质量控制密切相关；pH 值为氢离子浓度指数，是溶液中氢离子活动的一种标志；标准汤中固体物质的含量（solid content，SC）是制剂研究和质量控制的重要参考指标，通常采用烘干法进行测定；表面张力（γ）反映了药液中药物的溶解性，折光率（n）反映了药液的澄明度，均对制剂质量产生一定的影响[15]。

煮散粉碎粒度的确定是“遵古”开发的关键步骤，而有关粒度的研究报道未形成统一标准。对于古方中“粗末”，范佳佳等[16]提出为过20 目筛至50目筛的药材颗粒，而焦其树等[17]建议药材粉碎粒度为过10 目筛。因此，本研究以S、TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n为物理参数构建人参败毒标准汤物理指纹图谱，并以蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷为指标成分，对过10、24、50 目筛的人参败毒散制备标准汤的质量进行考察，以期为该方制剂开发和质量标准建立提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

De-100g 型高速万能粉碎机，浙江红景天工贸有限公司；AB265-S 型十万分之一分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；陶瓷煎药壶，潮州市潮安区康雅顺电器有限公司；便捷式电灶，佛山市顺德区金奇电器有限公司；KQ-250B 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；实验室PH 计，梅特勒-托利多仪器有限公司；DDSJ-308A 型电导率仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；接触角表面张力测量仪，丰度仪器科技有限公司；Agilent1260 型高效液相色谱仪，DAD 型检测器，美国Agilent 公司。

1.2 试剂

蛇床子素（批号T08M8B30733）、二氢欧山芹醇当归酸酯（批号P13J9F65515）、新橙皮苷（批号Y28F11Y16982）对照品购自上海源叶生物科技有限公司，质量分数均大于98%；柚皮苷（批号110722-200309）、甘草苷（批号111610-200604）对照品购自中国药品生物制品有限公司，质量分数均大于98%；磷酸、乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯；纯化水为实验室自制。

1.3 药材

羌活（批号20210125～20210130，四川）、独活（批号20201104～20201109，湖北）、北柴胡（批号20210103～2021011，陕西）、川芎（批号20201031、20201102～20201108，四川）、前胡（批号20200526～20200532，浙江）、枳壳（批号20210322～20210330，湖南）、桔梗（批号20210106～20210114，河北）、茯苓（批号20210121～20210129，湖南）、人参（批号 20210316～20210323，吉林）、甘草（批号20210109～20210117，甘肃）药材饮片均购于吉林省北药药材加工有限公司；羌活（批号200402～200404，青海）、独活（批号210401～210409，四川）、北柴胡（批号210404～210409，山西）、川芎（批号02221010～02221016，四川）、前胡（批号24320006～24320013，浙江）、枳壳（批号202102～202107，江西）、桔梗（批号38620017～38620022，安徽）、茯苓（批号210504～210509，安徽）、人参（批号39021007～39021013，吉林）、甘草（批号210501～210506，甘肃）药材饮片均购于吉林省宏检大药房有限公司；羌活（批号201101～201106，四川）药材饮片均购于豪州普润药业有限公司。羌活、独活、柴胡、川芎、前胡、枳壳、桔梗、茯苓、人参、甘草药材均经长春中医药大学肖井雷教授鉴定，分别为伞形科羌活属植物羌活NotopterygiumincisumTing ex H.T.Chang 的干燥根茎和根、伞形科当归属植物重齿毛当归Angelica pubescensMaxim.f.biserrataShan et Yuan 的干燥根、伞形科柴胡属植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根、伞形科川芎属植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根茎、伞形科前胡属植物白花前胡Peucedanum praeruptorumDunn 的干燥根、芸香科柑橘属植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实、桔梗科桔梗属植物桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根、多孔菌科茯苓属真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核、五加科人参属植物人参Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎、豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎的炮制加工品。

根据随机数表法对每批人参败毒标准汤的各药材进行随机排序组合，药材饮片批号信息见表1。

表1 15 批人参败毒标准汤药材饮片批号信息Table 1 Lot number information of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

2 方法与结果

2.1 人参败毒散的制备

根据《太平惠民和剂局方》记载，人参败毒散的制法为“上十味，各三十两，为粗末，每服二钱，水一盏，入生姜、薄荷各少许，同煎七分，去滓”[18]。在“遵古”核心思想下，经查阅文献报道[19-20]，明确宋代的“一两”约为40 g，“一钱”约为4 g，“一盏”相当于350 mL。生姜常用量为2～5 片[16]，“少许”生姜取2 片。

为了避免因方剂药材用量不同导致的差异，根据宋代药用情况结合课题组前期试验结果，确定标准汤剂中生姜用量为1 g，薄荷用量为0.5 g。选取过10、24、50 目筛的人参败毒散制备其标准汤剂，考察不同粉碎粒度对人参败毒散煎出物的影响。结果见表2，各批煮散的细粉含量均小于20%[21]。

表2 人参败毒散的粒度Table 2 Particle size of Renshen Baidu powder

2.2 人参败毒标准汤的制备

取羌活、独活、柴胡、川芎、桔梗、前胡、茯苓、枳壳（麸炒）、人参、甘草（炙）10 味药材饮片各40 g，粉碎，混匀。取混匀后的10 味药材饮片粉末16 g，生姜1 g，薄荷0.5 g，加入700 mL 水，武火煮沸，文火煎至药液490 mL，趁热滤过，即得人参败毒标准汤。按上述方法制备15 批人参败毒标准汤（编号为S1～S15）。

2.3 物理指纹图谱研究

2.3.1 物理指标的测定 将人参败毒标准汤冷却至室温，分别测定其S、TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n的值，结果见表3。

表3 标准汤物理质量属性检测结果Table 3 Detection results of physical parameters of standard decoction

2.3.2 物理参数标准化转换和相似度评价 由于物理指标的量纲之间存在差异，需将每个指标进行标准化至同一尺度，绘制指纹图谱。

根据药典标准以及文献报道[22-23]，将测得的物理指标数值控制在0～10，各物理指标转换公式见表4。将测定的各物理指标按转换公式标准化（表5），运用Origin 软件形成物理指纹图谱（图1），并对不同批次的标准汤进行相似度分析[24]，结果见表6。结果显示，标准汤S1～S5 的物理指纹图谱相似度为0.962～0.999，S6～S10 的物理指纹图谱相似度为0.969～1.000，S11～S15 的物理指纹图谱相似度为0.957～0.999，其他批次间的物理指纹图谱相似度均小于0.950。

表6 相似度评价Table 6 Similarity evaluation

图1 15 批人参败毒标准汤的物理指纹图谱Fig.1 Physical fingerprints of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

表4 标准汤物理质量指标的标准化转换方法Table 4 Standardization conversion method of physical quality index of standard decoction

表5 标准汤物理质量的标准化数值Table 5 Standard values of physical quality index of standard decoction

2.3.3 物理指纹图谱聚类分析 以15 批人参败毒标准汤的物理指纹图谱数据为变量，使用SPSS 20.0软件中的系统聚类法以平均欧氏距离为度量标准，进行层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA），结果见图2。结果可知，当距离为5 时，15批标准汤聚为3 类，标准汤S1～S5、S6～S10、S11～S15 各为一类，与相似度分析结果一致。

图2 15 批人参败毒标准汤的物理指纹图谱聚类分析Fig.2 HCA of physical fingerprints of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

2.3.4 物理指纹图谱的主成分分析（principal component analysis，PCA） 通过SIMCA-P 11.5 软件对15 批人参败毒标准汤的指纹图谱数据进行PCA。结果显示，特征值＞1 的主成分有3 个，方差贡献率分别为88.33%、9.32%、1.85%，累积方差贡献率为99.50%，基本可以客观反映供试品信息。Hotelling’sT2和DModX控制图（图3）显示，15 批人参败毒标准汤均在T2临界值（95%）警戒限和D临界值（0.05）控制限内，表明未出现异常批次的标准汤[15]。绘制PCA 得分图（图4），15 批标准汤可分为3 类，S1～S5 位于中间、S6～S10 位于右侧、S11～S15 位于左侧，与HCA 结果一致。

图3 15 批人参败毒标准汤的Hotelling’s T2 和DMod X 控制图Fig.3 Hotelling’s T2 and DMod X control charts of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

图4 15 批人参败毒标准汤PCA 得分图Fig.4 PCA score diagram of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

由载荷图（图5）可知，物理指标TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n对主成分1 的贡献较大；主成分2 中μ具有较大载荷，与其关联性较强。表明人参败毒标准汤的物理指纹图谱中TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n是其物理质量的差异性指标。

图5 15 批人参败毒标准汤的载荷图Fig.5 Loading diagram of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

2.4 多指标成分的含量测定

2.4.1 蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯色谱条件Agilent Zorbax Extend-C18（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）色谱柱；以乙腈-水（49∶51）为流动相；体积流量1.0 mL/min；检测波长为330 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。

2.4.2 甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色谱柱；以乙腈-0.05%磷酸水溶液（20∶80）为流动相；体积流量1.0 mL/min；检测波长为237 nm（甘草苷）、283 nm（柚皮苷、新橙皮苷）；柱温25 ℃；进样量10 μL。

2.4.3 蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯混合对照品溶液的制备 精密称取蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量，分别加甲醇制成含蛇床子素38.5 μg/mL、二氢欧山芹醇当归酸酯40.4 μg/mL 的混合对照品溶液，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷混合对照品溶液的制备 精密称取甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷对照品适量，分别加甲醇制成含甘草苷180 μg/mL、柚皮苷1211 μg/mL、新橙皮苷782 μg/mL 的混合对照品溶液，滤过，取续滤液，即得。

2.4.5 供试品溶液的制备 精密量取标准汤（相当于生药量4 g），蒸至近干，硅藻土分散，置100 mL圆底烧瓶中，加甲醇50 mL，称定质量，回流1 h，放冷后称定质量，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，置于蒸发皿中，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至5 mL，滤过，取续滤液，即得。

2.4.6 线性关系考察 分别精密称取蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量，加甲醇并分别稀释成蛇床子素质量浓度为76.93、38.47、15.39、7.69、3.85、1.92 μg/mL 的对照品溶液，二氢欧山芹醇当归酸酯质量浓度为101.82、50.91、25.45、12.72、6.36、3.18 μg/mL 的对照品溶液。分别精密量取混合对照品（质量浓度为甘草苷430 μg/mL、柚皮苷3010 μg/mL、新橙皮苷1946 μg/mL）1、2、4、6、8、10 mL 置于10 mL 量瓶中，甲醇定容到刻度。分别按“2.4.1”“2.4.2”项下色谱条件，重复进样3 次，以平均峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，计算线性回归方程，结果分别为蛇床子素Y＝34.542X＋42.92，r＝0.999 4，线性范围1.92～76.93 μg/mL；二氢欧山芹醇当归酸酯Y＝26.955X＋27.892，r＝0.999 7，线性范围3.18～101.82 μg/mL；甘草苷Y＝20 059X－29.005，r＝0.999 2，线性范围43～430 μg/mL；柚皮苷Y＝16 263X＋74.471，r＝0.999 3，线性范围301～3010 μg/mL；新橙皮苷Y＝18 936X－95.863，r＝0.999 3，线性范围194.6～1946.0 μg/mL。

2.4.7 精密度试验 取“2.4.3”“2.4.4”项下制备的混合对照品溶液各1 份，分别按“2.4.1”“2.4.2”项下色谱条件，连续进样6 次，计算各对照品峰面积的RSD 值，结果蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的RSD 分别为0.77%、0.46%、1.32%、1.71%、1.33%，表明该方法的精密度良好。

2.4.8 重复性试验 按“2.4.5”项下方法制备供试品溶液6 份，分别按“2.4.1”“2.4.2”项下色谱条件进样测定，计算蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷质量分数的RSD 值，结果RSD 分别为2.54%、2.09%、1.38%、1.07%、1.70%，表明该方法的重复性良好。

2.4.9 稳定性试验 按“2.4.5”项下方法制备供试品溶液1 份，分别按“2.4.1”“2.4.2”项下色谱条件，在制样后0、2、4、6、8、10、12、24 h 进行测定，通过计算得出蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷峰面积的RSD 值，结果分别为1.14%、1.53%、1.89%、0.51%、1.76%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.4.10 加样回收率试验 精密量取已知含量的标准汤适量（相当于生药量2 g），分别精密加入各对照品溶液，按“2.4.5”项下方法平均制备6 份供试品溶液，测得峰面积，计算平均加样回收率，结果蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的平均加样回收率分别为98.20%、98.82%、100.37%、99.67%、99.51%，RSD 分别为3.10%、2.90%、2.31%、2.49%、1.90%，结果表明该方法准确度良好。

2.4.11 含量测定 取“2.4.3”“2.4.4”项下制备的混合对照品溶液、“2.4.5”项下制备的供试品溶液，采用“2.4.1”“2.4.2”项下色谱条件，测定15 批人参败毒标准汤中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量，结果见表7。可知，标准汤S1～S5 中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的质量分数分别为0.063～0.072、0.109～0.116、0.436～0.451、2.861～2.971、1.839～1.888 mg/g，标准汤S6～S10中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的质量分数分别为0.168～0.189、0.270～0.299、0.582～0.632、3.551～3.855、2.220～2.431 mg/g，标准汤S11～S15 中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的质量分数分别为0.058～0.066、0.108～0.126、0.420～0.444、2.427～2.522、1.492～1.525 mg/g。

表7 15 批人参败毒标准汤中指标成分的含量测定结果Table 7 Determination results of index components in 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

2.5 指标成分HCA

以15 批人参败毒标准汤中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的质量分数为变量，使用SPSS 20.0 软件进行HCA，结果见图6。结果可知，当距离为5 时，15 批标准汤中S1～S5、S6～S10、S11～S15 各聚为一类，与物理指纹图谱HCA 结果一致。

图6 15 批人参败毒标准汤的指标成分含量HCA 图Fig.6 HCA of index component content of 15 batches of Renshen Baidu standard decoction

2.6 相关性分析

采用SPSS 20.0 软件对物理指纹图谱中S、TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n与蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量之间进行相关性分析。由表8 可知，物理指标TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n与蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量之间存在相关关系。其中，蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷与TDS、G、V、μ、SC、γ、n极显著相关（P＜0.01），柚皮苷、新橙皮苷与TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n极显著相关（P＜0.01）；蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量与物理指标TDS、G、pH、μ、SC、γ、n呈显著正相关，与V呈显著负相关。

表8 物理指标与指标成分含量的相关性Table 8 Correlation analysis of physical indexes and content of index components

3 讨论

标准汤剂是经典名方复方制剂的工艺优化和质量控制的物质基准[25]，而制备标准汤的散剂粒度是影响其质量的关键因素。本研究对人参败毒标准汤的S、TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n进行测定，构建其物理指纹图谱。由图谱可知，不同粉碎粒度煮散的物理参数之间有明显的差异，过24 目筛的各批次人参败毒标准汤的TDS、G、μ、SC、γ均相对较高。图谱相似度分析结果表明，过10、24、50目筛的人参败毒散制备标准汤的物理质量属性之间存在差异，HCA 结果进一步验证了不同粉碎粒度的煮散之间的差异性。经PCA 可知，15 批人参败毒标准汤未出现异常批次，不同粉碎粒度的人参败毒标准汤物理质量属性的差异性指标主要有TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n。15 批人参败毒标准汤中蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量测定结果表明，过24 目的煮散中各指标成分含量均高于过10、50 目的煮散。经HCA发现不同粉碎粒度的煮散各聚为一类，与物理指纹图谱分析结果一致。分析其原因，可能是过10 目筛的人参败毒散粉碎粒度过大，不利于有效成分的浸出，使其溶出率较低；而过50 目筛的人参败毒散粉碎粒度较小，易聚集成块，在煎煮过程中容易产生糊化，导致有效成分损失。因此，过24 目筛是人参败毒散最佳的粉碎粒度。物理指标S、TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n与蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量之间相关性分析结果显示，TDS、G、V、pH、μ、SC、γ、n与各指标成分的含量之间有显著相关性，表明标准汤的物理指标的变化与有效成分含量的增减之间存在密切关系。

本研究以物理指纹图谱、多指标成分含量结合多元统计分析的模式，从粉体学性质和化学成分两方面对不同粉碎粒度的人参败毒标准汤关键质量属性进行评价，为人参败毒散现代剂型开发及质量标准研究提供理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突