咖啡酸苯乙基酯缓解L02细胞脂毒性机制研究*

李亚萍，翟 嵩，王 媛，邓 江，吴凤萍，王沐淇，贾晓黎，李 梅，党双锁

有证据表明，脂肪酸是诱导非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)发生的重要因素[1-3]。过氧化物酶体增殖激活受体共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1α, PGC1α)参与了线粒体生物合成和线粒体氧化应激。在能量需求的情况下，这种核蛋白辅助转录因子调控了电子传递链、脂肪酸氧化、三羧酸循环和活性氧(reactive oxygen species, ROS)清除等一系列蛋白的表达过程。PGC1α也通过抑制核因子 κB(nuclear factor κB，NF-κB)参与了炎症反应的调控[4]。NAFLD患者肝脏PGC1α表达下降了40%，同时伴有线粒体功能异常、脂肪堆积和胰岛素抵抗[5，6]。小鼠肝组织脂肪含量与肝组织PGC1α表达呈正相关。在特异性敲除PGC1α小鼠，肝脏脂肪酸氧化显著降低，但却增加了胰岛素抵抗。PGC1α被认为是糖尿病和肥胖症重要的治疗靶点[7]。咖啡酸苯乙基酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)是来源于蜜蜂蜂巢的一种酚类化合物，在肿瘤、炎症反应、氧化应激和免疫调节等方面都具有重要的保护作用[8]。CAPE能够改善胰岛素抵抗和脂肪肝形成，从而能够促进减重[9，10]。本研究采用棕榈酸酯处理L02肝细胞系建立脂肪堆积肝细胞模型，主要目的是探讨CAPE是否通过调控PGC1α表达发挥其抑制NAFLD形成的作用。通过研究发现，上调PGC1α信号通路，CAPE对棕榈酸酯诱导的肝脏L02细胞脂毒性具有有效的保护作用。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 L02人正常肝细胞购自美国ATCC细胞公司； CAPE(Sigma公司)；棕榈酸酯(Sigma公司)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、 2× Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)；过氧化物歧化酶2(superoxide dismutase2, SOD2)、PGC1α和β-actin 的Real-time PCR 引物由北京擎科生物科技有限公司合成；检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素6(interleukin-6，IL-6)的ELISA试剂盒( R&D公司)；Mito-SOX Red购自Invitrogen公司； 抗PGC1α抗体(CST公司)；抗Tubulin 抗体(Sigma公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗、蛋白Marker、BCA蛋白定量试剂盒、化学发光液和甘油三酯(triglyceride, TG)检测试剂均购自美国Thermo公司；PGC1α shRNA和空载体慢病毒(西安天遇成生物科技有限公司)。

1.2 细胞培养与处理 在10%FBS高糖DMEM培养基，37°C、50 mL/L CO2培养箱中培养L02人源正常肝细胞和PGC1α敲减细胞系。这两种细胞分别设立高糖DMEM对照组、棕榈酸酯处理组(棕榈酸酯终浓度300 mM)、CAPE(CAPE终浓度10 μM)联合棕榈酸酯(棕榈酸酯终浓度300 mM)处理组，加入棕榈酸酯或棕榈酸酯联合CAPE培养细胞7 d。

1.3 PGC1α shRNA敲减细胞系的建立 PGC1α shRNA序列为5′-ATGACAGCTACGAGGAATAT-3′。接种野生型L02细胞于六孔板，待细胞50%融合时，按照MOI=80感染慢病毒，48 h后加入嘌呤霉素(puromycin)8 μg/ml，筛选2～3 d，后换正常完全培养基继续扩大培养。

1.4 细胞TG含量检测 待细胞90%以上融合时，收集细胞，采用RIPA细胞裂解液(碧云天生物技术有限公司)裂解细胞，10000 r/m离心15 min，取上清。用BCA蛋白定量试剂盒测蛋白含量。检测细胞上清TG含量。取细胞培养上清液，检测细胞因子水平。

1.5 线粒体ROS检测 使用MitoSOXTMRed Mitochondrial Superoxide Indicator 试剂盒(Thermo，美国)检测线粒体ROS水平。用5 μM MitoSOXTM试剂孵育细胞，37°C孵育15 min。PBS洗涤细胞2次，胰酶消化，收集细胞。在流式细胞仪(BD Accuri C6 Plus型，美国)检测平均红色荧光值。

1.6 细胞mRNA水平检测 采用qPCR定量检测，提取细胞总 RNA，取RNA 1 μg，反转录成cDNA；PCR引物: SOD2上游引物为5′-CCCTGGAACCTCACATCAAC-3′，下游引物为5′-GGTGACGTTCAGGTTGTT

CA-3′； PGC1α 上游引物为5′- CCTTGCAGCACAAGAAAACA -3′，下游引物为5′- TGACCGAAGTGCTTGTTCAG -3′；β-actin上 游 引 物 为 5′-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3′，下 游 引 物 为 5 ′ -CCATCTCTTGCTCGAAGTCT-3 ′。采用 2- △△Ct法，以 β-actin 为参照，计算mRNA相对水平。各组实验数据均独立重复3次，取均值。

1.7 细胞 PGC1α蛋白表达检测 采用Western-blot法，取细胞，加入RIPA裂解液提取蛋白。取蛋白20 μg上样， 200 v电泳1 h，半干转膜20 min， 加牛奶封闭液室温封闭2 h；加入一抗，4°C摇床孵育过夜；用TBST 洗膜5 min，共4 次。加入HRP 标记的山羊抗兔二抗，室温摇床孵育 1 h；用TBST 洗膜5 min，4 次。加入ECL化学发光液显影，在BioRad凝胶成像仪上成像，采用Image Lab 3.0软件分析结果。

2 结果

2.1 各组细胞TG、TNF-α和IL-6水平比较 棕榈酸酯处理组L02细胞TG含量为(16.9±1.4)mg/g protein，显著高于对照组[(4.92±0.48)mg/g protein，P<0.05]，棕榈酸酯与CAPE联合处理组细胞TG含量为(10.5±0.8)mg/g protein，显著低于棕榈酸酯处理组(P<0.05)；棕榈酸酯处理组细胞上清TNF-α和IL-6水平分别为(117.6±3.72)pg/ml和(67.9±2.7)pg/ml，显著高于对照组[分别为(49.49±1.70)pg/ml和(45.19±1.96)pg/ml，P<0.05]，棕榈酸酯与CAPE联合处理组TNF-α和IL-6水平分别为(74.88±3.37)pg/ml和(53.94±2.39)pg/ml，显著低于棕榈酸酯处理组(P<0.05)。

2.2 各组细胞线粒体ROS、SOD2和PGC1α mRNA水平以及PGC1α蛋白表达水平比较 与对照组比，棕榈酸酯处理组细胞线粒体ROS水平为(1.7±0.06)，显著高于对照组(P<0.05)，而棕榈酸酯与CAPE联合处理组细胞线粒体ROS水平为(1.36±0.04)，显著低于棕榈酸酯处理组(P<0.05，图1A)；棕榈酸酯处理组SOD2和PGC1α mRNA分别为(0.55±0.05)和(0.57±0.03)，均显著低于对照组(P<0.05)，棕榈酸酯与CAPE联合处理组分别为(0.76±0.03)和(0.73±0.04)，均显著高于棕榈酸酯处理组(P<0.05，图1B和2C)；棕榈酸酯处理组PGC1α蛋白表达显著低于对照组，而棕榈酸酯与CAPE联合处理组PGC1α蛋白表达显著高于棕榈酸酯处理组(图1D)。

图1 各组细胞内线粒体ROS、SOD2和PGC1α mRNA以及蛋白表达水平比较与对照组比，*P < 0.05；与棕榈酸酯组比，#P < 0.05

2.3 各组PGC1α敲除细胞TG、TNF-α、IL-6和线粒体ROS水平比较 成功建立PGC1α敲减的L02细胞系，检测发现，PGC1α敲除后棕榈酸酯处理组TG含量为(25.86±1.02)mg/g protein，显著高于对照组[(6.3±0.75)mg/g protein，P<0.05]，而棕榈酸酯与CAPE联合处理组TG含量为(23.73±1.95)mg/g protein，与棕榈酸酯处理组无显著性差异；棕榈酸酯处理组细胞上清TNF-α和IL-6水平分别为(145.78±5.79)pg/ml和(87.23±4.85)pg/ml，显著高于对照组[分别为(59.76±4.67)pg/ml和(54.23±4.76)pg/ml，P<0.05]，而棕榈酸酯与CAPE联合处理组分别为(128.33±4.41)pg/ml和(80.33±3.76)pg/ml，与棕榈酸酯处理组比较无显著性差异；棕榈酸酯处理组线粒体ROS水平为(2.05±0.14)，较对照组的(1.23±0.08，P<0.05)显著增加，而棕榈酸酯与CAPE联合处理组为(1.83±0.25)，与棕榈酸酯处理组比较无显著性差异。

3 讨论

CAPE是一种研究比较广泛的抗氧化剂[11]。多个研究发现，通过抗氧化作用，CAPE能够缓解包括糖尿病、脂肪肝在内的多种代谢性疾病[12-14]。但是，对于脂肪堆积导致的细胞脂毒性，CAPE是否具有保护作用及其作用机制并不清楚。在肝细胞中堆积的脂肪导致的脂毒性对于NAFLD的发展过程具有重要的作用。因此，我们在肝细胞系首次研究了CAPE对于游离脂肪酸诱导的脂毒性的作用。我们发现CAPE能够有效抑制棕榈酸酯诱导的细胞脂毒性。CAPE抑制了棕榈酸酯处理导致的TG含量增加，降低了细胞促炎因子TNF-α和IL-6的产生，降低细胞线粒体ROS水平。我们进一步证明了CAPE主要是通过PGC1α通路促进SOD2表达，改善线粒体氧化应激，并最终改善细胞脂毒性。

PGC1α是能量代谢的调控因子，调控线粒体生物合成、氧化呼吸和葡萄糖产生等。PGC1α的主要功能就是对线粒体ROS的解毒作用，从而增强线粒体功能[15，16]。运动、低温和饥饿等都是刺激PGC1α表达的物理因素[17，18]。最新研究表明，PGC1α介导了棕榈酸酯在脂代谢中的作用。棕榈酸酯主要是通过ERK和NF-NB通路[21]显著降低骨骼肌C2C12细胞PGC1α mRNA水平。本研究发现，在L02细胞，棕榈酸酯诱导PGC1α表达和线粒体抗氧化酶SOD2表达下降，同时伴随有线粒体ROS增加，炎症因子表达增加的脂毒性特征。给予CAPE处理能够显著逆转这一脂毒性改变。PGC1α敲除在很大程度上削弱了CAPE的治疗作用，提示CAPE是通过PGC1α通路改善线粒体功能和细胞脂毒性。

在脂肪细胞，CAPE处理能够诱导脂肪合成，并以TG的形式储存于脂肪细胞，抑制其分解，具有降低血脂的作用。在肝细胞，我们发现CAPE处理抑制了TG的合成，减少细胞脂质累积。