基于UHPLC-QTOF-MS/MS和分子对接筛选紫菀中润肠通便的效应成分

吴 浩，黄蓓蓓，贾志鑫，刘 洁，陈奕君，肖红斌*

1.北京中医药大学，北京 100029

2.广州中医药大学，广东 广州 510006

随着生物学和计算机科学等现代科学技术的发展，分子对接已成为药物靶点和药效成分筛选有力的工具，其原理就是利用计算机科学技术的相应的计算方法模拟分子的空间结构和分子间的相互作用力，通过研究分子间的空间作用力，寻找配体与受体活性位点的最佳结合方式的过程，在药物的研发中发挥着越来越重要的作用[1-2]。同时，得益于超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）的发展及其高分辨率、高灵敏度、高选择性等优势，可通过优化超高效液相色谱的色谱柱、流动相、洗脱条件等方式，结合四极杆飞行时间质谱中全面的数据采集方法及数据后处理分析策略，例如前体离子扫描，关键产物离子鉴别等，实现中药单味药、复方提取物及体内微量成分的准确高效全面的识别，为中药（复方）成分及其代谢产物的分析及鉴定提供了有效的助力[3-4]。

紫菀为菊科（Compositae）多年生草本植物紫菀Aster tataricusL.f.的干燥根及根茎，别名青菀、返魂草、小辫等，生长于海拔400～2000 m 的山坡湿地、低山草地及沼泽地等；在我国分布十分广泛，主产于山西、河北、东北、内蒙古东部等地区，也分布在朝鲜、日本等国。紫菀具有宣通肺气、润肠通便的功效，在临床上常配伍薏苡仁、桔梗、杏仁、枳壳、葶苈子等使用治疗术后便秘、肠痈等。现代药理学研究表明，紫菀还具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化活性、化痰止咳平喘等作用[5-19]。前期研究发现紫菀润肠通便的作用机制与细胞膜上的M 受体及钙离子通道有关[20]，但是对于紫菀中发挥作用的确切效应成分尚不清楚，需要进一步深入的研究。因此，本研究将通过 UHPLC-Q-TOFMS/MS 技术分析给药紫菀后的肠道内容物成分，针对与调节肠道的运动及平滑肌的收缩相关的M2、M3 受体蛋白和其下游信号通路中的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）蛋白，采用分子对接技术筛选与受体蛋白结合性较好的中药单体成分，进而阐明紫菀中润肠通便的效应成分，为后期的深入研究以及新药开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

本研究中使用的动物方案由北京中医药大学动物伦理审查委员会（批准号No.4-2018010103-10045）基于伦理程序和科学护理对其进行审核和批准。SD大鼠（180～220 g）购自北京维通利华动物科技有限公司。所有的动物均被饲养在恒温（25±2）℃，相对湿度（50±10）%和12 h 光/暗周期的环境下。

乙腈，LC/MS 级，Fisher 公司；甲醇，LC/MS级，Fisher 公司；甲酸，LC/MS 级，Sigma 公司；去离子水，Milli-Q 水净化系统自制；对照品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司，色谱纯，质量分数98%以上。

紫菀药材购自北京同仁堂药业有限公司，经北京中医药大学王学勇教授鉴定为紫菀A.tataricusL.f.的干燥根及根茎，药材（CMAT-AT-201904）存放在北京中医药大学中医药研究院中药分析与转化研究中心。

1.2 样品的制备

1.2.1 紫菀药材提取液的制备 紫菀药材200 g，料液比1∶10，50%的乙醇回流提取2 次，煮沸后，保持微沸1.5 h，用200 目滤布滤过，合并续滤液，用旋转蒸发仪（温度60 ℃、转速45 r/min）旋蒸至无醇味，得质量浓度为0.8 g/mL（生药量）的紫菀提取液。

1.2.2 肠道内容物供试品溶液的制备 SD 大鼠，3只，禁食18 h 后，ig 0.8 g/mL 的紫菀提取液，30 min后，水合氯醛麻醉，取出整段小肠，将肠内容物放入15 mL 离心管中，涡旋5 min 混匀，超声处理15 min，高速离心15 min（12 000 r/min、4 ℃），取上清液；加入4 倍量乙腈沉蛋白，涡旋5 min 后，高速离心15 min（12 000 r/min、4 ℃），取上清液，过0.22 µm 微孔滤膜；用真空旋转浓缩仪浓缩至干，50%的甲醇200 µL 复溶，涡旋5 min 后，高速离心15 min（12 000 r/min、4 ℃），取上清液，稀释10倍检测。

1.3 样品分析

液相色谱条件：样品的分离采用ACQUITY UPLC®HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters公司），柱温箱设定为30 ℃，检测波长设定为220、254、275、315 和360 nm；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～1 min，5%B；1～5 min，5%～15% B；5～15 min，15%～30%B；15～23 min，30%～75% B；23～25 min，75%～95%B，，进样体积为2 μL，体积流量为0.4 mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正负离子模式检测，详细的质谱参数如表1所示。

表1 正、负离子模式下的质谱参数Table 1 Mass spectrum parameters in positive and negative ion modes

1.4 分子对接

1.4.1 小分子配体的准备 小分子配体是基于“1.3”项中鉴定的肠道内容物的化学成分，通过TCMSP、Chemspider、Pubchem 等网站查找并下载化合物的结构式，保存为mol 格式。然后利用Chemidraw 14.0软件优化小分子配体的结构，采用MM2 力场进行能量最小化，保存为pdb 格式。

1.4.2 受体的准备 通过PDB 蛋白数据库下载蛋白的三维结构图，保存为pdb 格式，分辨率为0.3 nm，如图1所示，为M2 受体、M3 受体和PKC 蛋白的三维结构图。

图1 靶标蛋白的三维结构图Fig.1 Three-dimensional structure diagram of target protein

1.4.3 分子对接 运用SYBYL-X 2.0 软件将处理过的小分子配体与蛋白进行对接，首先是设置文件保存路径，接着导入对接的待测配体小分子，再导出待测配体小分子，选中所有的化合物，文件格式修改为SLN 格式，然后是处理靶标蛋白，提取靶标蛋白中与待测配体小分子相似的配体，同时移除配体外的其他配体及水分子，最后蛋白和待测配体小分子均处理完成后进行对接。

1.4.4 作图分析 首先，运用SYBYL-X 2.0 软件做图分析，可以得到受体-配体三维结合模式图及配体与氨基酸残基形成的氢键作用力图；然后，运用Discovery Studio 4.0 软件进行相关做图处理与分析，可以得到二维配体与氨基酸残基形成的所有作用力图；最后，分析图中配体与氨基酸残基结合作用力的大小。

2 结果

2.1 肠道内容物成分的鉴定

数据使用 Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.07.00 软件处理系统进行分析，在一级和二级质谱图中可获得总离子总离子流图（total ion chromatogram，TIC）、提取离子流图（extracted ion chromatogram，EIC）、DAD 色谱图、母离子及二级碎片离子等信息，并在此基础上通过与文献报道的紫菀药材成分及对照品进行比对，在根据特征碎片离子（如肽类的关键产物离子m/z106.064 9，有机酸类的关键产物离子m/z191.055 6，黄酮类的关键产物离子m/z153.018 0）、保留时间和clogP值等辅助鉴定，进而推导并确认待核查化合物的名称及结构[21]。利用上述分析方法，共鉴定出28 个化学成分，包括14 个肽类化合物，8 个有机酸类化合物，3 个黄酮类化合物和3 个香豆素类化合物（图2 和表2）。图3 为28 个化学成分的结构式。

图3 大鼠ig 紫菀提取液后肠道内容物中化合物分子结构式Fig.3 Molecular structure formula of compounds in intestinal contents of rats after ig A.tataricus

表2 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 鉴定的体内肠道内容物成分Table 2 Components of intestinal contents identified by UHPLC-Q-TOF-MS/MS

图2 正、负离子模式下的提取离子流图Fig.2 Extraction ion current diagram in positive and negative ion modes

2.2 分子对接结果

在本实验中，配体和受体的结合稳定性主要是基于Total Score 打分函数，Total Score 函数考虑了极性作用、疏水作用、焓和溶剂化等因素，TotalScore打分值越高结合性越好[22]。根据文献报道，本研究对接结果选择Total Score 值大于5 的化合物作为候选的活性成分，进行分子作用力的分析。

2.2.1 M2 受体与配体小分子的分子对接结果 分子对接结果如表3所示，有11 个化合物表现出良好的结合活性，Total Score 值均大于5，其中异绿原酸C 的Total Score 值最高，为8.077 8，其次为astin J 和山柰酚。图4 分别为异绿原酸C、astin J、山柰酚与M2 受体分子对接结合模式图及与氨基酸残基的相互作用图。根据图4 中3D 和2D 结合模式图，进一步分析了这些化合物与蛋白质的作用关系发现，异绿原酸C 与M2 受体的10 个氨基酸形成范德华力，与13 个氨基酸形成静电相互作用，并与108 号和404 天冬酰胺及426 号酪氨酸形成3 个氢键；山柰酚与M2 受体的4 个氨基酸形成范德华力，与12 个氨基酸形成静电相互作用，与104 号和426号酪氨酸、404 号天冬酰胺、429 号半胱氨酸形成4个氢键。化合物异绿原酸C 与M2 受体的相互作用力总数比山柰酚多6 个，说明异绿原酸C 与M2 受体的结合性强于山柰酚，与表3 中打分值结果一致。

图4 异绿原酸C、astin J 和山柰酚与M2 受体分子对接结合模式及与氨基酸残基的相互作用Fig.4 Molecular docking binding pattern diagram and interaction diagram of amino acid residues of isochlorogenic acid C,astin J and kaempferol with M2 receptor

表3 配体与蛋白的分子对接整体打分值Table 3 Total score of ligand and protein with molecular docking

2.2.2 M3 受体与配体小分子的分子对接结果 如表3所示，与M3 受体分子对接的结果中Total Score大于5 的有13 个化合物，Total Score 值排名前3 的分别为asterin F、astin J 和异绿原酸B。图5 分别为asterin F、astin J、异绿原酸B 与M3 受体分子对接结合模式图及与氨基酸残基的相互作用图，从图中可知，asterin F 与M3 受体的13 个氨基酸形成范德华力，与11 个氨基酸形成静电相互作用，与148号酪氨酸、152 号天冬酰胺、238 号丙氨酸、503 号色氨酸和507 号天冬酰胺形成6 个氢键作用，并且与503 号色氨酸形成σ-π 超共轭和529 号酪氨酸形成π-π 共轭效应；异绿原酸B 与M3 受体的12 个氨基酸形成范德华力，与11 个氨基酸形成静电相互作用，与222 号异亮氨酸、426 号天冬酰胺、506 号酪氨酸和532 号半胱氨酸形成4 个氢键，并且与506号酪氨酸形成π-π 共轭效应。化合物asterin F 和异绿原酸B 与M3 受体结合过程中都形成了共轭效应，asterin F 与M3 受体的相互作用力数总数大于异绿原酸B，因此，Total Score 值更大，结合力更强。

图5 Asterin F、astin J 和异绿原酸B 与M3 受体分子对接结合模式及与氨基酸残基的相互作用Fig.5 Molecular docking binding pattern diagram and interaction diagram of amino acid residues of asterin F,astin J and isochlorogenic acid B with M3 receptor

2.2.3 PKC 蛋白与配体小分子的分子对接结果如表3所示，与PKC 蛋白分子对接的结果中Total Score 值大于5 的有23 个化合物，Total Score 值排名前3 的分别为astin J、异绿原酸C 和astin E。根据图6 可得，astin J 与PKC 的10 个氨基酸形成范德华力，与13 个氨基酸形成静电相互作用，与253号精氨酸、256 号酪氨酸、257 号丙氨酸、289 号色氨酸、293 号谷氨酸、371 号赖氨酸和387 号天冬氨酸形成9 个氢键；Astin E 与PKC 的6 个氨基酸形成范德华力，与11 个氨基酸形成静电相互作用，与氨基酸残基形成7 个氢键。在与PKC 蛋白对接中发现，astin J、异绿原酸C 和astin E 与PKC 蛋白的氢键作用力较多，Total Score 打分值更高。

图6 Astin J、异绿原酸C 和astin E 与PKC 蛋白分子对接结合模式及与氨基酸残基的相互作用Fig.6 Molecular docking binding pattern diagram and interaction diagram of amino acid residues of astin J,isochlorogenic acid C and astin E with PKC protein

3 讨论

便秘是一种常见的消化系统疾病，便秘的调节与分布在肠道上的神经递质与其受体密切相关，肠道上分布有多种神经递质，如Ach、NE、5-HT 等，这些神经递质释放后，通过突触间隙，直接与其特异性受体结合发挥生理效应，进而调节肠道的运动和分泌[23-25]。目前认为，与Ach 结合的M 受体和Ca2+通道在便秘的发生中起主要的作用，M 受体分为M1、M2、M3、M4、M5 5 个亚型，但是研究发现M2 和M3 受体亚型在调节肠道的运动及平滑肌的收缩中起着更重要的作用[26]，同时，PKC 蛋白作为Ca2+通道调控机制的下游蛋白，其可被细胞质中的Ca2+激活，从而发挥调控肠道运动的作用[27]。前期研究也发现紫菀润肠通便的作用机制与细胞膜上的M 受体及Ca2+通道相关[20]，但是对于紫菀中润肠通便的效应物质尚不明确，因此，本研究采用M受体中与调节肠道的运动及平滑肌的收缩密切相关的M2、M3 受体亚型蛋白和Ca2+依赖性的PKC 蛋白作为靶标蛋白，通过分子对接技术与给药紫菀后的肠道内容物成分进行对接，筛选出紫菀中润肠通便的活性成分。结果表明，肠道内容物中含有28个紫菀中的化学成分，经分子对接筛选出astin J、asterin F、asterin A、异绿原酸C、异绿原酸A、异绿原酸B、绿原酸、槲皮素、山柰酚和木犀草素共10 个成分均可与M2 受体、M3 受体及PKC 蛋白体现出良好的分子对接活性，其中astin J 与3 种靶标蛋白的Total Score 值的平均值最高，且以上10 种活性成分与3 种靶蛋白的对接区域和内源性配体的结合位置基本相同。目前，已有文献报道槲皮素通过调节M 受体及其下游信号PKC 蛋白的表达发挥治疗洛哌丁胺所致的便秘[28]，在本研究筛选出的10个活性成分中，有7 个成分与3 种靶标蛋白结合的平均打分值强于槲皮素，这也保证了实验结果的可靠性。因此，推测以上10 个潜在的化合物可能是治疗便秘的最主要的活性成分，这也契合了中药多成分、多靶点、多途径的作用特点，但是对于这些成分确切的治疗效果还需要进一步用细胞或动物实验进行验证。同时，本实验为进一步研究紫菀通便的活性提供一定的理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突