山橙中生物碱类化学成分的研究

李 瑞，方忠莹，杨梓依，方 磊*，周 洁,*

1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355

2.济南大学生物科学与技术学院，山东 济南 250022

山橙Melodinus suaveolensChamp.ex Benth.为夹竹桃科（Apocynaceae）山橙属MelodinusJ.R.et G.Forst 木质藤本植物。山橙属植物全世界约有53 种，主要分布于亚洲热带、亚热带地区及大西洋地区。我国有11 种，主产于广西、云南、贵州以及台湾等地区[1]。山橙属植物在我国民间应用历史悠久，常用于治疗小儿疝气、小腹痛、睾丸炎、小儿脑膜炎、骨折和风湿性心脏病等[2]。山橙属植物中的化学成分丰富，包括生物碱、三萜、木脂素类等[3-6]。其中，生物碱类成分是该属植物最重要的活性成分，其结构复杂多样，具有多样的生物活性，如抗炎、抗肿瘤等[7-10]。目前，从山橙中分离得到40 余个生物碱，结构类型包括单萜吲哚生物碱、单萜喹啉生物碱、双吲哚生物碱等，其中单萜吲哚生物碱多具有显著的抗肿瘤活性，具有较大的研究和开发价值[11-14]。本研究采用酸溶碱沉法富集山橙茎的乙醇提取物氯仿部位中的生物碱类成分，进一步运用正相硅胶柱色谱、半制备高效液相色谱等多种色谱方法从中分离得到12 个生物碱类成分，利用一维和二维核磁共振波谱、高分辨质谱以及圆二色谱等技术分别鉴定为 melosuavine A（1）、柳叶水甘草碱（tabersonine ，2）、 3-羰基柳叶水甘草碱（3-oxotabersonine，3）、白坚木胺（quebrachamine，4）、Δ14-长春布宁（Δ14-vincamone，5）、Δ14-vincamenine（6）、3-羰基-11-甲氧基柳叶水甘草碱（3-oxo-11-methoxytabersonine，7）、alstoyunine G（8）、pachysiphine（9）、洛柯宁碱（lochnerinine，10）、土波台文碱（tubotaiwine，11）、venalstonine（12）。结构见图1。其中，化合物1 为新化合物，命名为美乐苏胺A。化合物4、11 和12 首次从该植物中分离得到。采用MTT 法评价了所得化合物的肿瘤细胞增殖抑制活性，化合物2、8～10 显示出不同程度的肿瘤细胞增殖抑制活性，其中化合物10 活性最强。

图1 化合物1～12 的结构Fig.1 Chemical structures of compounds 1—12

1 仪器与材料

Bruker Avance DRX600 型核磁共振波谱仪（瑞士Bruker 公司），Agilent 6250 Accurate-Mass Q-TOF高分辨质谱仪（美国 Agilent 公司），Agilent 1260-6460 Triple Quad 液质联用仪（美国Agilent 公司），Chirascan 圆二色谱仪（英国 Applied Photophysics 公司），Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），TBE-300C 高速逆流色谱仪（上海同田生物技术有限公司），EYELA R-100型旋转蒸发仪（日本EYELA 公司），YMC-Pack ODS-A 型半制备色谱柱（250 mm×10 mm，5 µm，日本YMC 公司），正相柱色谱硅胶（200～300 目，青岛海洋化工厂），多功能酶标仪（美国赛默飞公司），BP221S 型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司），Milli-Q 纯水仪（美国Millipore 公司），所用试剂为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）或色谱纯（瑞典Oceanpak 公司）。DMEM 培养基、1640 培养基、胎牛血清、胰酶溶液均购自美国Gibco公司，MTT 购自Solabio 公司，顺铂（Pt 65%，上海麦克林生化科技股份有限公司）。人肺癌A549 细胞、人肝癌HepG2 细胞和人前列腺癌PC-3 细胞购于中国科学院上海细胞库。

山橙釆自云南普洱，经山东中医药大学李佳教授鉴定为夹竹桃科植物山橙M.SuaveolensChamp.ex Benth.的枝叶，样品标本（201512TM03）保存于济南大学生物科学与技术学院标本室。

2 提取与分离

山橙药材（16.8 kg）粉碎后，用8 倍体积95%乙醇渗漉提取3 次，合并滤液，减压浓缩得到乙醇浸膏。将乙醇浸膏加水分散，用稀盐酸调节pH 为1～2，用醋酸乙酯萃取3 次，合并有机相，减压浓缩得到非生物碱相。水相用氨水调节pH 为9～10，用氯仿萃取5 次，合并氯仿相，减压浓缩得到氯仿相即总生物碱相（149 g）。然后将总生物碱相进行硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（200∶1～5∶1）为流动相梯度洗脱，经TLC 分析后合并为6 个部位（Fr.1～6）。

Fr.3 利用高速逆流色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水为溶剂体系，经HPLC 分析合并得到6个组分Fr.3.1～3.6。Fr.3.1 经半制备HPLC（甲醇-水85∶15）分离得到化合物2（12.0 mg，tR＝20 min）；Fr.3.2 利用Sephadex LH-20（甲醇）进行分离，进一步通过半制备HPLC（甲醇-水65∶35）得到化合物3（5.2 mg，tR＝22 min）、7（10.4 mg，tR＝25 min）和8（2.6 mg，tR＝30 min）；Fr.3.3 经硅胶柱色谱（石油醚-醋酸乙酯30∶1～1∶1）进行分离，进一步通过半制备HPLC（甲醇-水83∶17）得到化合物9（2.5 mg，tR＝20 min）和10（12.1 mg，tR＝25 min）；Fr.3.4 利用硅胶柱色谱（石油醚-醋酸乙酯30∶1～1∶1）进行分离，进一步通过半制备HPLC（甲醇-水80∶20）得到化合物11（4.0 mg，tR＝20 min）和12（1.1 mg，tR＝25 min）；Fr.3.5 利用Sephadex LH-20（甲醇）分离后，通过半制备HPLC（甲醇-水90∶10）分离纯化到化合物4（2.0 mg，tR＝16 min）。

Fr.4 以石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水为溶剂体系，使用高速逆流色谱进行分离，经HPLC 分析合并得到6 个组分Fr.4.1～4.6。Fr.4.2 经硅胶柱色谱（石油醚-醋酸乙酯30∶1）、Sephadex LH-20（甲醇）分离后，进一步通过半制备HPLC（甲醇-水65∶35）纯化得到化合物1（2.0 mg，tR＝20 min）。

Fr.5 利用石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水为溶剂体系，通过高速逆流色谱分离得到6 个组分Fr.5.1～5.6。Fr.5.2 进一步通过硅胶柱色谱（石油醚-醋酸乙酯20∶1）、Sephadex LH-20（甲醇）分离后，然后利用半制备HPLC（甲醇-水80∶20）纯化得到化合物6（1.7 mg，tR＝35 min）；Fr.5.3 经Sephadex LH-20（甲醇）、半制备HPLC（甲醇-水75∶35）分离纯化到化合物5（1.0 mg，tR＝23 min）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末（甲醇）；HR-ESI-MS 显示准分子离子峰[M＋H]+m/z365.1497（计算值365.149 6），结合1H-NMR 和13C-NMR 数据，确定其分子式为C21H20N2O4，不饱和度为13。1H-NMR谱（表1）可以明显看出一组1,2-二取代苯环信号δH6.72(1H,d,J= 7.8 Hz,H-12),7.14(1H,t,J= 7.8 Hz,H-11),7.24(1H,d,J= 7.8 Hz,H-9),7.25(1H,t,J= 7.8 Hz,H-10)；2 组烯烃信号δH5.65(1H,dt,J=10.0,2.0 Hz,H-14),5.69(1H,d,J= 10.0 Hz,H-15)和δH5.00(1H,d,J= 10.9 Hz,H-18a),4.94(1H,d,J= 17.6 Hz,H-18b),5.72(1H,dd,J= 17.6,10.9 Hz,H-19)；1 组连氮亚甲基信号δH4.50(1H,dd,J= 18.0,4.5 Hz,H-3a),3.39(1H,dd,J= 18.0,2.0 Hz,H-3b)；2组脂肪族亚甲基信号δH3.08(1H,d,J= 18.6 Hz,H-6a),2.62(1H,d,J= 18.6 Hz,H-6b)和3.00(1H,d,J= 13.9 Hz,H-17a),2.50(1H,d,J= 13.9 Hz,H-17b)，1 个连氮次甲基信号δH3.92(1H,s,H-21)，1 个甲氧基信号δH3.65(3H,s,OCH3)。13C-NMR 数据（表1）中，除了与上述基团对应的碳信号外，还显示2 个芳香族季碳信号δC126.6(C-8),134.3(C-13)，3 个脂肪族季碳信号δC53.4(C-7),63.9(C-16),47.9(C-20)以及3 个羰基碳信号δC166.8(C-2),170.6(C-5),169.5(CO2CH3)，见图1。

表1 化合物1 的1H-和13C-NMR 数据(600/150 MHz,CDCl3)Table 1 1H-and 13C-NMR data of compound 1(600/150 MHz,CDCl3)

1H-1H COSY 谱显示化合物1 中存在3 个自旋偶合系统H-9/H-10/H-11/H-12、H-3/H-14/H-15 和H-18/H-19，结合HMBC 谱中显示的远程相关信号：H-3/C-5,C-21、H-6/C-7,C-8、H-9/C-8,C-7、H-12/C-13、H-15/C-20,C-21、H-17/C-2,C-16、H-19/C-17,C-20 和H-21/C-7,C-16，可推断出1 与已知化合物scandine 具有相同的结构骨架[15]。进一步通过HMBC 远程关信号H-3,H-6/C-5 和高分辨质谱推断出，1 与scandine 相比，5 位亚甲基碳变为羰基碳，由此确定了化合物1 的平面结构。在ROESY谱中，通过H-9/H-21、H-6/H-OCH3以及H-21/H-19的相关信号，表明H-6/H-OCH3、H-21/H-19 位于同侧，与scandine 型生物碱的相对构型一致[16]。以上2D-NMR 谱中主要相关信号见图2。

图2 化合物的关键和相关信号Fig.2 Key and ROESYcorrelations of compound 1

化合物1 的绝对构型是通过通过计算ECD 和实验ECD 比较来确定的。化合物1 可能存在1a 和1b 两种绝对构型，通过比较其ECD 实验谱图与计算ECD 的数据确定1 的绝对构型（图3）。实验表明，化合物1 的实验ECD 谱（MeOH）在207 nm（Δε ＋37.5）和257 nm（Δε ＋7.3）处有正性Cotton效应，与1a 的计算ECD 的谱图（MeOH）基本吻合，从而确定了 1 的绝对构型与 1a 一致，为7S,16R,20R,21S，命名为美乐苏胺A（melosuavine A）。

图3 化合物1 的2 种可能绝对构型及其实验和计算ECD 谱Fig.3 Two possible absolute configurations and experimental and calculated ECD spectra of compound 1

化合物2：白色粉末；ESI-MSm/z337.1 [M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:8.99(1H,s,NH),7.23(1H,d,J= 7.6 Hz,H-9),7.14(1H,t,J= 7.6 Hz,H-10),6.82(1H,d,J= 7.6 Hz,H-12),6.87(1H,t,J= 7.6 Hz,H-11),5.79(1H,m,H-14),5.71(1H,m,H-15),3.77(3H,s,OCH3),3.46(1H,m,H-3a),3.19(1H,d,J= 15.0 Hz,H-17a),3.05(1H,m,H-3b),2.71(1H,m,H-5a),2.68(1H,s,H-21),2.55(1H,d,J= 15.0 Hz,H-17b),2.44(1H,m,H-6a),2.07(1H,m,H-5b),1.80(1H,m,H-6b),0.99(1H,m,H-19a),0.86(1H,m,H-19b),0.64(3H,t,J= 7.5 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:167.0(C-2),51.1(C-3),50.7(C-5),44.7(C-6),55.3(C-7),138.2(C-8),121.6(C-9),120.7(C-10),127.8(C-11),109.4(C-12),43.3(C-13),125.0(C-14),133.3(C-15),92.3(C-16),27.1(C-17),7.6(C-18),28.6(C-19),41.5(C-20),70.2(C-21),51.1(COOCH3),169.2(COOCH3)。以上数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物2 为柳叶水甘草碱。

化合物3：无色油状物；ESI-MSm/z373.1 [M＋Na]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:9.04(1H,s,NH),7.23(1H,t,J= 7.2 Hz,H-11),7.23(1H,d,J=7.2 Hz,H-9),6.95(1H,t,J= 7.2 Hz,H-10),6.89(1H,d,J= 7.2 Hz,H-12),6.45(1H,d,J= 10.0 Hz,H-15),5.96(1H,d,J= 10.0 Hz,H-14),4.31(1H,m,H-5a),3.98(1H,s,H-21),3.79(3H,s,OCH3),3.38(1H,m,H-5b),2.62(1H,d,J= 15.5 Hz,H-17a),2.07(1H,d,J= 15.5 Hz,H-17b),1.95(1H,m,H-6a),1.89(1H,m,H-6b),1.09(1H,m,H-19a),1.00(1H,m,H-19b),0.72(3H,t,J= 7.4 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:165.5(C-2),161.6(C-3),43.5(C-5),43.5(C-6),56.8(C-7),135.7(C-8),128.8(C-9),121.4(C-10),121.6(C-11),110.0(C-12),143.0(C-13),123.0(C-14),145.3(C-15),90.3(C-16),26.1(C-17),7.5(C-18),27.3(C-19),40.6(C-20),66.7(C-21),51.4(COOCH3),168.5(COOCH3)。以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物3 为3-羰基柳叶水甘草碱。

化合物4：淡黄色粉末；ESI-MSm/z305.1 [M＋Na]+，分子式为C19H26N2。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.70(1H,s,NH),7.48(1H,d,J= 7.3 Hz,H-9),7.29(1H,d,J= 7.3 Hz,H-12),7.07(1H,m,H-10),7.07(1H,m,H-11),3.25(1H,m,H-3a),2.94(1H,m,H-6a),2.84(1H,m,H-6b),2.74(1H,m,H-16a),2.68(1H,m,H-16b),2.45(1H,s,H-21a),2.44(1H,m,H-5a),2.33(1H,m,H-5b),2.25(1H,s,H-21b),1.92(1H,m,H-17a),1.61(1H,m,H-17b),1.59(1H,m,H-15a),1.50(1H,m,H-3b),1.30(1H,m,H-14a),1.23(1H,m,H-15b),1.22(1H,m,H-19a),1.15(1H,m,H-19b),1.12(1H,m,H-14b),0.85(3H,t,J= 7.6 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:140.0(C-2),56.8(C-3),53.4(C-5),22.1(C-6),108.8(C-7),129.1(C-8),117.5(C-9),118.8(C-10),120.3(C-11),110.1(C-12),134.9(C-13),34.9(C-14),22.9(C-15),22.6(C-16),33.6(C-17),8.0(C-18),32.2(C-19),37.3(C-20),55.2(C-21)。以上数据与文献报道基本一致[19]，故鉴定化合物4 为白坚木胺。

化合物5：淡黄色粉末；ESI-MSm/z293.5[M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:8.20(1H,m,H-12),7.44(1H,m,H-9),7.25(1H,m,H-10),7.26(1H,m,H-11),5.61(1H,m,H-14),5.55(1H,d,J=10.5 Hz,H-15),4.23(1H,s,H-21),3.51(1H,m,H-3a),3.43(1H,m,H-5a),3.36(1H,m,H-5b),3.13(1H,m,H-3b),3.07(1H,m,H-6a),2.96(1H,d,J=16.5 Hz,H-17a),2.68(1H,d,J= 16.5 Hz H-17b),2.56(1H,m,H-6b),1.98(1H,m,H-19a),1.74(1H,m,H-19b),1.03(3H,t,J= 7.6 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:134.2(C-2),44.7(C-3),50.2(C-5),17.1(C-6),133.9(C-7),131.5(C-8),119.2(C-9),125.3(C-10),125.0(C-11),116.8(C-12),135.5(C-13),127.7(C-14),128.6(C-15),169.1(C-16),43.8(C-17),8.6(C-18),34.6(C-19),42.2(C-20),57.2(C-21)。以上数据与文献报道基本一致[20]，故鉴定化合物5 为Δ14-长春布宁。

化合物6：淡黄色粉末；ESI-MSm/z277.5[M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.45(1H,d,J=8.0 Hz,H-9),7.32(1H,d,J= 8.0 Hz,H-12),7.17(1H,t,J= 8.0 Hz,H-10),7.09(1H,t,J= 8.0 Hz,H-11),6.95(1H,d,J= 7.9 Hz,H-16),5.52(1H,m,H-15),5.35(1H,m,H-14),4.97(1H,d,J= 7.9 Hz,H-17),4.38(1H,s,H-21),3.49(1H,m,H-3a),3.37(1H,m,H-3b),3.10(1H,m,H-5a),2.66(1H,m,H-6a),2.55(1H,m,H-5b),2.18(1H,m,H-6b),1.76(1H,m,H-19a),1.75(1H,m,H-19b),1.04(3H,t,J= 7.6 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:133.8(C-2),43.6(C-3),50.6(C-5),16.8(C-6),113.4(C-7),129.2(C-8),108.8(C-9),113.2(C-10),121.9(C-11),107.4(C-12),133.7(C-13),122.8(C-14),127.6(C-15),118.6(C-16),120.1(C-17),9.3(C-18),33.6(C-19),39.0(C-20),64.6(C-21)。以上数据与文献报道基本一致[21]，故鉴定化合物6 为Δ14-vincamenine。

化合物7：白色粉末；ESI-MSm/z403.1 [M＋Na]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:9.00(1H,s,NH),7.11(1H,d,J= 8.0 Hz,H-14),6.46(1H,dd,J=7.8,2.0 Hz,H-10),6.45(1H,d,J= 7.8 Hz,H-9),6.43(1H,brs,H-12),6.00(1H,d,J= 10.0 Hz,H-15),4.30(1H,m,H-5a),3.93(1H,s,H-21),3.80(3H,s,COOCH3),3.78(3H,s,OCH3),3.35(1H,m,H-5b),2.60(1H,d,J= 15.5 Hz,H-17a),2.05(1H,d,J= 15.5 Hz,H-17b),1.93(1H,m,H-6a),1.86(1H,m,H-6b),1.09(1H,m,H-19a),1.01(1H,m,H-19b),0.72(3H,t,J= 7.4 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:166.0(C-2),161.6(C-3),43.6(C-5),43.4(C-6),56.2(C-7),128.1(C-8),123.0(C-9),105.7(C-10),160.8(C-11),97.3(C-12),144.3(C-13),123.0(C-14),145.3(C-15),90.6(C-16),26.0(C-17),7.5(C-18),27.3(C-19),40.7(C-20),66.8(C-21),55.7(OCH3),51.5(COOCH3),168.5(COOCH3)。以上数据与文献报道基本一致[22]，故鉴定化合物7 为3-羰基-11-甲氧基柳叶水甘草碱。

化合物8：淡黄色粉末；ESI-MSm/z419.1 [M＋Na]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:8.95(1H,s,NH),7.10(1H,d,J= 8.0 Hz,H-9),6.48(1H,d,J=2.1 Hz,H-12),6.43(1H,dd,J= 8.0,2.1 Hz,H-10),4.43(1H,m,H-5a),3.81(3H,s,COOCH3),3.79(3H,s,OCH3),3.62(1H,s,H-21),3.61(1H,d,J= 3.8 Hz,H-14),3.47(1H,d,J= 3.8 Hz,H-15),3.20(1H,m,H-5b),2.66(1H,d,J= 16.0 Hz,H-17a),1.85(1H,d,J= 16.0 Hz,H-17b),1.73(1H,m,H-6a),1.68(1H,m,H-6b),1.28(1H,m,H-19a),1.09(1H,m,H-19b),0.78(3H,t,J= 7.2 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:166.3(C-2),164.8(C-3),43.4(C-5),41.9(C-6),56.7(C-7),127.5(C-8),121.8(C-9),105.5(C-10),160.7(C-11),97.2(C-12),143.9(C-13),51.1(C-14),57.1(C-15),88.9(C-16),22.2(C-17),7.2(C-18),26.2(C-19),40.6(C-20),63.3(C-21),55.5(11-OCH3),51.2(COOCH3),168.2(COOCH3)。以上数据与文献报道基本一致[23]，故鉴定化合物8 为alstoyunine G。

化合物9：淡黄色粉末；ESI-MSm/z353.1 [M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:8.93(1H,s,NH),7.14(1H,t,J= 7.6 Hz,H-10),7.14(1H,t,J= 7.6 Hz,H-11),6.86(1H,d,J= 7.6 Hz,H-9),6.81(1H,d,J=7.6 Hz,H-12),3.79(3H,s,COOCH3),3.75(1H,m,H-5a),3.56(1H,m,H-3a),3.51(1H,m,H-14),3.49(1H,m,H-5b),3.48(1H,m,H-15),3.11(1H,s,H-21),2.88(1H,m,H-17a),2.85(1H,m,H-3b),2.48(1H,m,H-17b),1.94(1H,m,H-6a),1.71(1H,m,H-6b),1.13(1H,m,H-19a),0.89(1H,m,H-19b),0.74(3H,t,J=7.5 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:167.8(C-2),50.3(C-3),51.2(C-5),44.9(C-6),54.1(C-7),137.6(C-8),121.6(C-9),120.8(C-10),127.9(C-11),109.6(C-12),143.1(C-13),50.8(C-14),50.3(C-15),90.8(C-16),23.4(C-17),7.4(C-18),24.5(C-19),41.2(C-20),67.7(C-21),51.3(COOCH3),169.0(COOCH3)。以上数据与文献报道基本一致[24]，故鉴定化合物9 为pachysiphine。

化合物10：白色粉末；ESI-MSm/z383.0 [M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:8.90(1H,s,NH),7.01(1H,d,J= 8.1 Hz,H-12),6.40(1H,d,J= 2.2 Hz,H-9),6.38(1H,dd,J= 8.1,2.2 Hz,H-10),3.79(3H,s,OCH3),3.77(3H,s,COOCH3),3.50(1H,m,H-3a),3.49(1H,m,H-14),3.48(1H,m,H-15),3.11(1H,m,H-3b),2.87(1H,m,H-5a),2.86(1H,m,H-17a),2.85(1H,s,H-21),2.57(1H,m,H-5b),2.45(1H,m,H-6a),2.44(1H,m,H-17b),1.92(1H,m,H-6b),1.14(1H,m,H-19a),0.75(1H,m,H-19b),0.74(3H,t,J= 7.5 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:168.3(C-2),50.8(C-3),51.3(C-5),44.9(C-6),54.1(C-7),130.1(C-8),121.9(C-9),105.1(C-10),160.2(C-11),97.0(C-12),144.3(C-13),54.4(C-14),57.4(C-15),91.0(C-16),23.3(C-17),7.4(C-18),24.5(C-19),41.2(C-20),67.8(C-21),57.4(OCH3),50.8(COOCH3),169.0(COOCH3)。以上数据与文献报道基本一致[25]，故鉴定化合物10 为洛柯宁碱。

化合物11：白色粉末；ESI-MSm/z325.2 [M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:8.85(1H,s,NH),7.13(1H,d,J= 7.3 Hz,H-9),7.09(1H,m,H-11),6.87(1H,t,J= 7.3 Hz,H-10),6.79(1H,d,J= 7.7 Hz,H-12),3.79(1H,m,H-21),3.76(3H,s,COOCH3),3.03(1H,m,H-17),3.01(1H,m,H-5a),2.94(1H,m,H-6a),2.89(1H.m.H-3a),2.83(1H,m,H-5b),2.44(1H,m,H-3b),1.96(1H,m,H-20),1.79(1H,m,H-6b),1.78(1H,m,H-14a),1.77(1H,m,H-14b),0.81(2H,m,H-19),0.69(3H,t,J= 7.3 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:170.9(C-2),45.4(C-3),54.2(C-5),44.2(C-6),55.3(C-7),137.4(C-8),119.7(C-9),121.1(C-10),127.3(C-11),109.8(C-12),143.8(C-13),28.7(C-14),95.8(C-16),31.1(C-17),11.7(C-18),24.1(C-19),41.4(C-20),65.8(C-21),51.3(COOCH3),169.1(COOCH3)。以上数据与文献报道基本一致[26]，故鉴定化合物11 为土波台文碱。

化合物12：白色粉末；ESI-MSm/z337.2[M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.08(1H,d,J=7.8 Hz,H-12),7.02(1H,t,J= 7.8 Hz,H-10),6.75(1H,t,J= 7.8 Hz,H-11),6.70(1H,d,J= 7.8 Hz,H-9),5.72(1H,m,H-14),5.70(1H,m,H-15),3.74(3H,s,COOCH3),3.46(2H,m,H-3),3.09(1H,m,H-5a),2.89(1H,m,H-5b),2.88(1H,m,H-16),2.71(1H,s,H-21),2.68(1H,m,H-17a),2.57(1H,m,H-6a),1.90(1H,m,H-18a),1.66(1H,m,H-17b),1.35(1H,m,H-6b),1.33(1H,m,H-19a),1.25(1H,m,H-19b),1.23(1H,m,H-18b)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:66.7(C-2),49.3(C-3),50.1(C-5),36.5(C-6),56.3(C-7),149.3(C-8),111.2(C-9),126.8(C-10),119.4(C-11),121.4(C-12),139.9(C-13),127.1(C-14),132.8(C-15),43.6(C-16),31.7(C-17),34.3(C-18),29.7(C-19),35.3(C-20),67.0(C-21),51.9(COOCH3),174.1(COOCH3)。以上数据与文献报道基本一致[27]，故鉴定化合物12 为venalstonine。

4 细胞毒活性

采用MTT 法[10]评价了化合物1～12 对3 种人源型肿瘤细胞（A549、HepG2 和PC-3）的体外细胞增殖抑制活性，以顺铂为阳性对照。结果表明，化合物1、3～7、11 和12 均无活性；化合物2、8～10 显示出不同程度的肿瘤细胞增殖抑制活性（表2）；化合物10 对A549、HepG2 和PC-3 肿瘤细胞具有显著的增殖抑制活性，半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）分别为7.11、0.84、3.78 μmol/L。

表2 抗肿瘤活性评价(±s,n=3)Table 2 Anti-tumor screening results(±s,n=3)

表2 抗肿瘤活性评价(±s,n=3)Table 2 Anti-tumor screening results(±s,n=3)

化合物 IC50/(μmol·L-1)A549 HepG2 PC-3 2 60.80±3.68 26.74±3.68 25.07±2.71 8 28.94±3.47 1.18±0.34 2.44±1.72 9 40.67±10.14 9.45±2.96 19.42±3.85 10 7.11±0.99 0.84±0.80 3.78±1.83顺铂 57.26±3.34 14.35±0.85 40.75±9.58

5 讨论

本研究运用多种色谱手段，从山橙属植物山橙茎的乙醇提取物氯仿部位中分离得到12 个生物碱类成分，其中化合物1 为新化合物，化合物4、11和12 首次从该植物中分离得到，并对以上化合物进行了细胞毒活性测试。化合物2、8～10 显示出不同程度的肿瘤细胞增殖抑制活性，又以化合物10抗肿瘤活性最强，推测14、15 位的环氧结构、11位的甲氧基和20 位的乙基是这类生物碱具备显著活性的必要条件，上述推测需获得更多该类成分进行验证。综上，本研究进一步丰富了山橙属植物生物碱类化学成分，也为此类成分进一步的抗肿瘤作用研究提供了参考和依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突