兔源大肠杆菌的分离鉴定

王新新，任 曼，孙 浩

（1.塔里木大学动物科学与技术学院 843300；2.新疆阿克苏地区民政局 843000）

大肠埃希氏细菌隶属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）﹑埃希氏菌属（Escherichia）﹑大肠杆菌种（coli），是革兰氏阴性的直杆菌，无芽孢[1-3]，兼性厌氧，常存在于人和动物的肠道。致病性大肠杆菌常引起幼龄动物严重腹泻和败血症[4-6]。兔大肠杆菌病（rabbits colibacillosis）又名黏液性肠炎，以幼龄兔发生流涎﹑腹泻﹑排鼠粪样或透明胶胨样粪为主要特征[7]，在兔养殖业中常见并危害较大的一种疾病。本试验对某兔场的疑似病例开展病原分离鉴定，并对其进行动物试验，从而对兔源大肠埃希氏菌的分离鉴定和兔大肠杆菌病的实验室诊断提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

病料来自新疆阿拉尔市某兔场。采集腹泻症状的兔子粪样﹑病死兔的肠内容物和肝脏。样品均无菌采集，并装入无菌处理的密封袋和冻存管，单独标记，置于-20℃冰箱保存备用。

1.1.2 主要试剂

普通琼脂（LB）固体培养基﹑麦康凯培养基﹑伊红美蓝培养基﹑SS琼脂培养基﹑葡萄糖发酵管﹑甘露醇发酵管﹑麦芽糖发酵管﹑蔗糖发酵管﹑乳糖发酵管﹑卫矛醇发酵管等均购自杭州天和微生物试剂有限公司；革兰氏染色试剂盒鉴定套装，购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.1.3 仪器设备

GEX-9272MBE型电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；LDZX-40Bl型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产品；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；超净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；HPX-9272MBE数显不锈钢电热培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品。

1.2 试验方法

1.2.1 分离纯化及生长特性鉴定

按照无菌操作方法取兔小肠内容物和粪便样品，用生理盐水稀释后用移液枪滴加到麦康凯培养基上并用涂布棒进行涂布均匀（分别标号为肠内容物﹑1号粪便﹑2号粪便），在肝组织切面上用涂布棒蘸取肝切面后移于麦康凯培养基上涂布均匀（标号为肝组织）,置37℃温箱中培养24h，观察菌落形态。

按照无菌操作方法从麦康凯琼脂平板上挑取单个红色菌落[14]，接种于伊红美蓝琼脂平板﹑SS琼脂平板﹑普通琼脂固体培养基上，于37℃温箱中培养24h。

生长特性的鉴定依据：大肠杆菌在普通琼脂培养基上生长成光滑﹑白色或灰白色菌落；在伊红美蓝琼脂培养基上生长成黑色带有金属光泽的菌落；在麦康凯培养基上生长成红色或粉红色菌落；在SS琼脂平板上生长不良或不生长[3]。

1.2.2 染色镜检

按照革兰氏染色试剂盒鉴定套装说明书进行染色，镜检。

判定标准：经革兰氏染色的大肠杆菌在光学显微镜下呈红色﹑两端钝圆﹑短杆状[3]。

1.2.3 生化试验

1.2.3.1 糖发酵试验

选取葡萄糖﹑乳糖﹑卫矛醇﹑蔗糖﹑甘露醇﹑麦芽糖六种糖分别在微量反应管中进行糖发酵试验。使用微量反应管时，轻轻用钳子夹断以上无培养基的玻璃管，然后用在酒精灯灼烧的接种针蘸取相对应的已经培养好的纯菌种接种，放在37℃恒温箱过夜培养，18～24 h观察并记录观察结果。

1.2.3.2 硫化氢试验

蘸取被检细菌的纯培养物，接种于硫化氢微量反应管中，放在37℃恒温培养箱中培养1～2 d后观察结果。

1.2.3.3 触酶试验

用酒精灯灼烧的接种环将被检菌落放于载玻片1/3处，滴加一滴3%双氧水于菌落上，立即观察是否有气泡产生。

1.2.3.4 枸橼酸盐利用试验

将从兔肠段上取得的被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于35℃恒温培养1～4 d，每日观察记录。

1.2.4 动物试验

取1号粪便﹑2号粪便﹑肠内容物中分离鉴定的大肠杆菌，分别注射5只昆明小鼠。1号粪便中分离鉴定的大肠杆菌分别注射5只昆明小鼠（注射剂量均为0.5mL）。注射后连续观察48h并记录结果。

2 结果

2.1 分离培养结果

通过分离培养，分别从标号1号粪便﹑2号粪便和肠内容物的培养基上得到三株疑似菌（分别标记为1F﹑2F﹑C）。1F﹑2F上得到的疑似菌在普通琼脂培养基上生长良好，形成光滑﹑灰白色菌落（图1），在麦康凯培养基形成红色圆形菌落（图2），在伊红美兰琼脂平板上长出黑紫色带金属光泽的圆形菌落（图3），SS琼脂培养基未形成肉眼可见的菌落。

图1 2F LB培养基

图2 2F 麦康凯培养基

图3 1F 伊红美蓝培养基

2.2 生化试验结果

见表1及图4～9。

表1 生化试验结果

图4 1F

图5 2F

图6 1F

图7 2F

图8 C

图9 硫化氢试验

2.3 动物试验结果

注射2号粪便和肠内容物中分离的菌株，5只昆明小鼠在12 h内死亡3只；解剖观察后发现，腹腔有少量积液，肝脏边缘变黑，其它实质脏器眼观无明显病理变化。注射1号粪便中分离的菌株，5只昆明小鼠均未发现引起死亡。

3 讨论

本试验采集新疆阿拉尔市某兔场疑似大肠杆菌病例的病料，对其进行了细菌培养，形态学观察（革兰染色镜检），生化试验及试验动物感染试验。病料通过预处理后，分别接种到普通琼脂培养基﹑麦康凯培养基﹑伊红美蓝培养基﹑SS琼脂培养基。经过培养后，标记为1号粪便﹑2号粪便和肠内容物的培养基中均培养出类似大肠杆菌的菌落，生长特性均符合要求。分别挑取单个菌落，涂片，革兰氏染色镜检。结果发现，均为革兰氏阴性（红色）﹑两端钝圆﹑成双或散装排列的短杆菌，形态特征符合预期要求。

通过形态学观察的单个菌落进行纯化增菌后，对其开展了生化试验，从生化试验结果来看，肠内容物糖发酵试验结果与其他两组试验结果有较大区别，1号粪便与2号粪便糖发酵试验结果中葡萄糖﹑卫矛醇﹑乳糖都是产酸产气，而肠内容物试验结果只有葡萄糖产酸产气，卫矛醇既不产酸也不产气其他两个不产气，乳糖只产酸不产气，蔗糖试验结果只有1号粪便产酸产气其他两组不产酸产气，麦芽糖和甘露醇三组都是只产酸不产气。枸橼酸盐利用试验三组都无颜色变化。硫化氢试验中三组都无颜色变化。各种生化特性均符合于大肠肝菌，从而确定此3株细菌为大肠杆菌。

再进一步对昆明小鼠进行感染试验发现，2号粪便和肠内容物中分离的菌株具有致死性，而1号粪便分离的菌株未引起试验动物死亡。从而确定，2号粪便和肠内容物中分离出的菌株具有致病特性。

4 结论

本试验采集疑似大肠杆菌病的兔子病料，对其开展细菌分离培养，染色镜检和生化试验。最终，从中分离出3株疑似菌。经过生长特性﹑形态学观察和生化特性鉴定后，确定其为大肠杆菌。通过感染试验发现，其中2种菌株具有致病特性。