抗抑制素α纳米抗体真核表达载体的构建

贾昊天，马继福，吾热力哈孜·哈孜汗

（石河子大学动物科技学院 832000）

抑制素主要是由性腺所分泌的一种糖蛋白激素，抑制素有两种类型（抑制素A和抑制素B），两者具有相同的α-亚基，而β-亚基因N-端氨基酸序列的差异而分为βA和βB，α-亚基和βA﹑βB通过二硫键连接分别形成抑制素A和抑制素B[1]。抑制素A和抑制素B具有相似的生物活性，均可选择择性地抑制SH的合成与分泌，从而降低血液中的FSH水平[2]。其中α-亚基上有两个N端连接的糖基化位点，被认为是抑制素发挥生物学功能的活性中心，已有研究表明抑制素在卵泡生长﹑发育﹑闭锁和排卵过程中起重要作用[3-4]，此外国内外大量研究人员利用抑制素α（INHα）免疫来提高动物机体FSH水平，且有文献证明INHα基因免疫不仅可以提高动物体内FSH水平，还可以提高排卵率和产仔数[5-8]。但由于目前所产生的INHα免疫制剂（INHα抗原和INHα抗体）由于产量低和免疫原性较差的问题，很难进行推广使用。

重链抗体（HCAb）是在驼类动物血清中发现的一种特殊IgG，因其天然缺失轻链和第一恒定区（CHⅠ），所以被称为重链抗体。重链抗体的N端区域为抗原结合结构域（VHH），也被称为纳米抗体，与常规抗体中的Fab片段相比，VHH就是功能和结构片段。纳米抗体分子结构的特殊性，使其具备了传统抗体不具备的优势：即分子量小﹑免疫原性低﹑易于表达﹑组织穿透力强[9]﹑稳定性强[10]﹑高抗原结合力。此外纳米抗体能够通过血脑屏障并迁移到中枢神经系统的组织中[11]，这使得纳米抗体具有很强的使用价值，在许多方面可替代普通抗体，弥补普通抗体的不足。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及载体 DH5α感受态细胞购自北京索莱宝科技有限公司；克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司；真核表达载体PcDNA3.1由新疆生产建设兵团绿洲生态实验室保存；抗抑制素α纳米抗体（Nb4）基因为本课题组利用噬菌体展示技术从前期构建的抗抑制素α纳米抗体文库中淘选获得。

1.1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶EcoRI和HindIII﹑胰蛋白胨﹑琼脂粉购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒﹑DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技。

1.1.3 主要仪器 普通PCR（labcyIer48）仪购自德国Sensoquest公司；冷冻高速离心机（legendmicro17R型）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Nb4基因真核表达载体的构建

1.2.1.1 引物的设计 使用双峰驼纳米抗体基因通用引物VHH-F与VHH-R，再设计出1对带有 EcoR I 和 Hind III 2 个内切酶酶切位点的引物，以与真核表达载体相连。序列信息见表 1：

表1 Nb4基因引物序列

1.2.1.2 Nb4基因的克隆 以实验室保存的pCantab 5E-Nb4模板用抗抑制素α纳米抗体的特异性引物（上下游各引物分别加入EcoR I﹑Hand Ⅲ的酶切位点，上游：5′CCGGAATTCCGGCAGGTCCAACTGCAGGAGTCT3′；下游：5′CCCAAGCTTGG GTGAGGAGACGGTGACCTGGGT 3′）PCR扩增目的基因，PCR体系（20μL）：模板2μL，上﹑下游引物各0.4μL，Mix 12.5μL，dd H2O 9.7μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性40 s；57℃退火1min；72℃延伸30s；共30个循环；72℃再延伸10min；4℃保存，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收。

1.2.1.3 pMD19-Nb4重组质粒的构建及鉴定 对PCR产物胶回收后与pMD19-T载体进行16℃水中过夜连接，待连接反应完成后将连接产物转入大肠杆菌的感受态细胞中。挑取数个单克隆菌落进行菌液PCR，对含菌液PCR成功的单克隆菌落以1∶1000体积比，向氨苄抗性的LB液体培养基中加入20μL单克隆菌液，适宜条件下过夜培养对过夜培养物进行重组克隆质粒的提取，将提取的重组质粒用EcoRI和HindIII两种限制性内切酶37 ℃双酶切3h，并对双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后将目的基因条带进行胶回收。

1.2.1.4 PcDNA3.1-Nb4重组质粒的构建及鉴定 对pMD19-Nb4重组质粒进行酶切的同时，对本实验室保存的PcDNA3.1菌株扩繁后进行质粒提取。并使用EcoR I和HindIII限制性内切酶双重消化PcDNA3.1载体，进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的消化产物。将回收的Nb4基因片段与回收的PcDNA3.1载体进行16℃水浴过夜连接，转化感受态细胞DH5α，涂布LB固体氨苄培养基，37℃的培养箱中培养过夜。挑出单菌落进行菌液PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的菌落进行过夜扩大培养，次日提取菌液质粒，用双酶消化鉴定。然后送至测序并与模板序列比对。将菌液PCR鉴定正确的菌液使用25%甘油管保存于-20℃。

2 结果

2.1 Nb4基因原核表达载体的构建

2.1.1 Nb4基因克隆结果

PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳结果显示产生一条450 bp左右的特异性目的条带（图1），PCR产物与目的基因条带大小相符。

图1 Nb4基因PCR扩增结果

2.1.2 pMD19-Nb4重组质粒构建与鉴定结果

将PCR扩增的Nb4基因与pMD19-T载体连接转化感受态细胞DH5α感受态细胞后挑取单菌落进行菌液PCR，琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物大小与NB4基因大小一致（图2）。挑选其中阳性菌进行扩繁后提取质粒，质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳结果显示出一条2600bp和一条450bp的条带（图3）。与目的基因条带大小相符，初步判断pMD19-Nb4重组质粒构建成功。

图2 菌液PCR结果

图3 pMD19-Nb4重组质粒双酶切结果

2.1.3 PcDNA3.1-Nb4重组质粒的构建及鉴定结果

将回收的Nb4基因片段与回收的PcDNA3.1载体进行连接及转化感受态细胞DH5α细胞后，对菌液PCR阳性的单菌落进行扩繁，提取质粒进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳结果显示出一条5900bp和一条450bp的条带（图4），与预期结果一致。测序结果显示测序与Nb4基因序列完全一致，无突变情况，判断成功构建pET 32a-Nb4重组质粒。

图4 PcDNA3.1-Nb4重组质粒双酶切结果

3 讨论

本实验根据载体构建的传统流程，从克隆载体的连接到真核表达载体的构建，不同于现在的直接连接真核表达载体，虽然多了一个连接克隆载体的步骤，但是可以保留克隆载体，以方便以后构建其他载体时直接进行酶切连接。