接触辉光放电等离子体对Fusarium solani的杀菌作用机制及动力学模型研究

万强贵 王 婷 田立鹏 李春爱 蔡 梦 蒲陆梅

（甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州 730070）

茄病镰刀菌（Fusarium solani）是一种自然界中分布广泛的真菌类群，其抗逆性强，寄主生存方式多样，是一些重要农业植物的宿主特异性病原体。相关研究表明，Fusarium solani能引起黄瓜冠腐病、牡丹根腐病以及豆科和瓜类植物根茎腐烂病等［1-3］，这些病害严重影响了我国的农业生产，造成了巨大的经济损失。此外，在免疫力低下或免疫力障碍的患者中，Fusarium solani还可引发侵袭性真菌病，严重时可造成生命体死亡［4］。

目前，关于控制Fusarium solani病害的方法，主要包括物理、化学、生物防治等。物理和化学防治是采用各种试剂或紫外线辐射处理等，杀菌效果好，使用方便，但长期使用不仅会增强病原菌抗药性，而且会造成严重的环境污染［5-7］，危害人体健康。生物防治是利用一些具有拮抗作用的菌种进行防控，如木霉属［8］、菌种提取物［9］等，但它们对温度、湿度等环境因素要求较高［10］。因此，寻找一种安全高效、无污染、易实行的处理方法至关重要。

接触辉光放电等离子体（contact glow discharge plasma，CGDP）作为一种新兴的高级氧化技术，在材料合成［11］、废水处理［12］、生物医药［13］等方面取得了广泛的应用。研究也表明，CGDP产生的高能活性粒子对细菌、真菌和病毒等具有较高的清除率［14］。此外，CGDP还具有操作简单、反应条件温和等特点，其生成的强氧化性物质·OH和H2O2等，特别适用于食品中毒素的降解以及微生物的灭活［15］，且无二次污染物的生成，是一种更安全、更高效、更环保的技术方法。

本研究以Fusarium solani作为目标菌株，通过CGDP处理，研究电压强度、孢子初始浓度、抗坏血酸浓度对杀菌效果的影响，通过菌落生长情况、细胞膜完整性、孢子形态、活性粒子（·OH、H2O2、NO3-）浓度、pH值等指标分析CGDP的杀菌机制；采用Linear、Weibull和Log-Logistic 3种数学模型分析不同电压下辉光放电等离子体杀菌动力学特性，旨在筛选最适合描述低温等离子体杀菌过程的动力学模型，为低温等离子体杀菌技术的发展提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Fusarium solani菌株由甘肃农业大学理学院实验室提供（从当归中分离）。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）、孟加拉红琼脂（rose bengal agar，RBA），青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；无水硫酸钠，分析纯，上海中泰化学试剂有限公司；甲基紫，分析纯，上海中泰化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

接触辉光放电等离子体发生器（自制，图1）；LDZX-50KBS型立式高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；HPX-150恒温恒湿培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；DH1722A-6型直流稳压稳流电源，北京大华无线电仪器厂；CX221 FS1C型生物显微镜，奥林巴斯（广州）工业有限公司；JSM-6360LV扫描电子显微镜，日本电子株式会社；PHS-3C酸度计，上海平轩科学仪器有限公司；TU-1901紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

图1 试验装置Fig.1 Experimental setup

1.3 试验方法

1.3.1 CGDP的产生及·OH、H2O2、NO3-浓度和pH值的测定 如图1所示，CGDP发生及反应系统由反应器和高压直流电源两部分组成。反应器中的阳极为直径0.5 mm的铂电极，阴极为直径1 cm的碳棒电极。反应器外设循环水浴控制温度。调节电压至铂电极发生稳定辉光放电而使水分子活化并产生等离子体。为防止样品中其他因素的干扰，本试验采用无菌水代替样品，以检测CGDP处理过程中活性粒子浓度的变化。540 V电压下，取一定体积的无菌水，其他条件相同，进行放电处理，每隔5 min取样，共30 min，平行3次。溶液中NO3-浓度采用二磺酸酚分光光度法进行测定［16］；·OH的测定参考杜明远等［17］的方法，以甲基紫为捕获剂；H2O2测定使用南京建成过氧化氢（H2O2）试剂盒。

1.3.2 菌株活化和孢子悬浮液的制备 取培养7 d的Fusarium solani一皿，加入10 mL无菌水（含有0.01 mL吐温80），使用无菌三角涂布器刮下菌落，四层无菌纱布过滤，所得溶液即为孢子悬浮液。吸取1 µL孢子悬浮液至血球计数板，置于显微镜下计数，无菌水稀释调节孢子浓度至2 × 106CFU·mL-1。

1.3.3 CGDP对杀菌效果的影响 为了研究电压、处理时间、孢子初始浓度和抗坏血酸浓度对等离子体杀菌效果的影响。取50 mL无菌水，通过调节电源电压从0 V增加到650 V，测定电流随电压的变化曲线，确定CGDP产生的电压范围；取50 mL浓度为2×106CFU·mL-1的孢子悬浮液在不同电压（500、520、540、560、580 V）下用CGDP处理；取50 mL不同初始浓度（4×105、2×106、3×106、4×106CFU·mL-1）和含有不同浓度抗坏血酸（5、10、20 mmol·L-1）的孢子悬浮液，分别在540 V下用CGDP处理。所有样品每隔5 min取样，共30 min，平行3次，将取好的样品于25 ℃恒温培养3 d，采用平板计数法进行菌落总数的计数。等离子体对Fusarium solani的杀菌效果用孢子减少量表示。孢子减少量为处理样品和未处理样品菌落计数的对数之差，见公式（1）。

式中，N：处理后样品的菌落数，CFU·mL-1；N0：处理前样品的菌落数，CFU·mL-1；lgS：杀菌处理前后菌落总数降低的对数。

1.3.4 CGDP处理对Fusarium solani生长、细胞膜完整性及孢子形态的影响 取50 mL浓度为2×106CFU·mL-1的孢子悬浮液，540 V条件下，CGDP处理0（CK）、5、10、15、20、25和30 min后分别测定其各种生理指标。孢子萌发率参考杜明远等［17］的方法，通过生物显微镜观察统计孢子萌发数；通过十字交叉法测定菌落直径和菌丝生物量；核酸泄漏量和蛋白质泄漏量通过紫外吸收法测定，核酸泄漏量和蛋白质泄漏量分别用OD260和OD280表示；孢子碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色参考王志芳等［18］的方法，并通过荧光显微镜观察结果；扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）前处理参考潘春青［19］的方法，在5 000倍扫描电镜视野下观察、拍照。

1.3.5 杀菌动力学模型及评价 常见的动力学模型有三类，分别是Linear模型、Weibull模型和Log-Logistic模型。运用MatLab1.0.01软件分别对所得的数据进行模型拟合，得到不同电压下CGDP处理过程中，Fusarium solani菌落数下降值随处理时间变化的动力学方程。并且引入相关系数（R2）、精确因子（Af）、偏差因 子（Bf）和 均方 根方 差（root mean square error，RMSE）四个参数评价拟合效果。其中R2是评价模型拟合优度的度量值，值越接近1代表模型拟合程度越佳；Af和Bf为预测值与实测值的偏离程度，Af与Bf值越接近1，代表预测值与实测值偏离程度越低；RMSE表示模型拟合的精确性，值越小代表模型拟合精确度越高。其表达式如表1所示。

表1 3种动力学模型数学表达式及模型参数Table 1 Mathematical expressions and model parameters for three kinetic models

1.4 数据处理

所有试验重复3次，采用Excel 2016和SPSS 21.0软件进行数据处理和方差分析（analysis of variance，ANOVA），结果表示为平均值±标准偏差（P<0.05），并用Origin 2018和MatLab1.0.01软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 CGDP对·OH、H2O2、NO3-浓度及pH值的影响

等离子体杀菌过程中，由于受等离子体自身粒子不稳定性以及细胞多样性影响，其杀菌机理目前仍处于探索阶段，其中公认最多的是等离子体氧化杀菌。CGDP处理时，当施加于针状电极的电压达到某一击穿电压时，电极附近的水分子会被活化成H2O+，并通过电子转移产生·OH和·H，进而生成H2和O2，这一区域又被称为等离子体区。在等离子体区附近的液相区，液体中的水分子又与来自电极附近的H2O+gas相互撞击分解成H和O，进一步生成H2O2；同时水分子还与H2O+发生电荷转移生成·OH，这些物质从等离子体层迁移，进而充满整个溶液。它们不但可以相互作用，还可以与底物发生反应［13］。

另外，在放电过程中还会形成活性氮粒子，这些粒子在水中形成亚硝酸和硝酸等酸性物质，使样品酸化，从而抑制菌体生长。

表2为540 V电压下CGDP处理后测量得到的·OH、H2O2、NO3-浓 度 和pH值。与0 min相比，CGDP处理30 min，·OH和H2O2浓度分别增加到1.57 mg·L-1和73.89 mmol·L-1，且表现出显著差异（P<0.05）；NO3-浓度在30 min内随着处理时间的延长而线性增加，最高达到12.72 mg·L-1；pH值经CGDP处理后从7.07降低到4.66（30 min）。Annachiara等［20］在分析气体等离子体对水溶液中化学物质的影响时也得到了类似的结果，并推测活性粒子浓度的增加可能是微生物失活的主要原因。

表2 540 V条件下CGDP过程中·OH、H2O2、NO3-浓度及pH值Table 2 ·OH， H2O2 and NO3- concentrations and pH in the CGDP process at 540 V

2.2 CGDP伏安特性

CGDP处理过程中电流-电压关系如图2所示。结果表明，电流随电压的变化主要分为3个阶段：AB段为普通的电解过程，在此范围内电流与电压呈线性正相关关系，并符合法拉第定律；BC段为不稳定区，前期电流随电压的增大而急剧下降，并伴随着气泡的产生，之后随着电压的增大出现剧烈波动；CD段为辉光放电区，当电压调节到C点（500 V）时，电极尖端开始出现紫色的辉光，且随着电压的增大辉光放电逐渐稳定，水分子被活化并产生等离子体，此段也称为等离子体区。本试验选择辉光放电稳定的最低电压为540 V。

图2 CGDP处理过程中电流-电压特征曲线Fig.2 Current-voltage characteristic curve during CGDP processing

2.3 电压及处理时间对CGDP杀菌效果的影响

在能够稳定产生CGDP的电压范围内，本试验研究了电压在500～580 V之间CGDP处理对Fusarium solani杀菌效果的影响。结果表明（表3），在相同的处理时间下，随着电源电压的升高，Fusarium solani孢子的存活数逐渐降低；在相同的电压下，随着处理时间的延长，样品中孢子存活数逐渐减少。当电压为500 V时，与对照相比，CGDP处理20 min时，孢子对数值下降了0.19 lg（CFU·mL-1），继续升高电压为560 V时，样品中孢子对数值下降了2.5 lg（CFU·mL-1），大多数孢子被杀死，当电压升高到580 V时，可杀死全部孢子。此外，当电压为540 V时，CGDP处理20 min使孢子对数值下降了2.66 lg（CFU·mL-1），继续延长处理时间至25 min时，样品中没有活孢子检出。杀菌效果是处理时间及电压强度共同作用的结果，因此，后续研究采用电压强度作为动力学研究的变量。

表3 电压及处理时间对Fusarium solani孢子杀菌效果的影响Table 3 Effect of voltage and time on the fungicidal effect of Fusarium solani spores /lg（CFU·mL-1）

2.4 抗坏血酸对CGDP杀菌效果的影响

由图3可知，540 V电压下，CGDP处理后，随着处理时间的延长，对照组菌落存活数逐渐减少，杀菌效果增强。当加入一定浓度的抗坏血酸后，菌落存活数增加，杀菌效果减弱。加入5 mmol·L-1的抗坏血酸，CGDP处理30 min时，与对照相比，菌落存活数下降了3.6 lg（CFU·mL-1）。继续提高抗坏血酸浓度到10 mmol·L-1和20 mmol·L-1，菌落存活数下降速率降低，CGDP处理20 min时，菌落存活数仅为对照组的46.4%和56.9%，基本保持不变。这可能是抗坏血酸的浓度过高所导致，此时抗坏血酸对活性氧的抑制即将达到饱和状态。

图3 抗坏血酸对Fusarium solani孢子杀菌效果的影响Fig.3 Effect of ascorbic acid on the fungicidal effect of Fusarium solani spores

2.5 Fusarium solani孢子初始浓度对CGDP杀菌效果的影响

电源电压540 V下，考察Fusarium solani不同孢子浓度对CGDP杀菌效果的影响，结果如图4所示。在不同的初始浓度条件下，CGDP对Fusarium solani孢子都有着明显的杀菌效果。当初始浓度为4×105CFU·mL-1时，CGDP处理20 min，可全部杀死样品中孢子，当初始浓度为2×106、3×106CFU·mL-1时，杀死全部孢子所需时间分别为25和30 min。继续提高孢子初始浓度至4×106CFU·mL-1时，CGDP处理30 min未能杀死全部孢子。由此可知，提高孢子浓度会降低杀菌效率。

图4 Fusarium solani孢子初始浓度对CGDP杀菌效果的影响Fig.4 Effect of initial concentration of Spores of Fusarium solani on bactericidal effect of CGDP

2.6 CGDP处理对Fusarium solani生长、细胞膜完整性及孢子形态的影响

微生物结构的完整性是保证其生长及各种代谢活动的基础。表4反映了CGDP处理对Fusarium solani孢子生长抑制以及细胞膜破坏作用。结果表明，随着CGDP处理时间的延长，菌落直径整体显著减小（P<0.05）。处理时间为0 min时，对照组菌落直径为5.53 cm，而处理时间为20 min时，菌落直径减小至3.23 cm，仅为对照组的58.4%；继续延长处理时间至25 min，未发现菌丝生长。另外，菌丝生物量和孢子萌发率也随着CGDP处理时间的延长而显著降低（P<0.05）。处理时间为20 min时，菌丝生物量为对照组的4.45%，孢子萌发率较比照组下降98.47个百分点；继续延长处理时间，Fusarium solani无孢子萌发，菌丝生物量也无积累，此结果与菌落直径对应，同时也证明CGDP处理25 min可对Fusarium solani孢子达到完全灭活。

表4 CGDP处理对Fusarium solani孢子生长及细胞膜完整性的影响Table 4 Effect of CGDP treatment on the growth and cell membrane integrity of Fusarium solani spores

碘化丙啶（PI）不能透过完整的细胞膜，但能染红细胞膜有破损的细胞。由表4可知，Fusarium solani胞内核酸泄漏量随着CGDP处理时间的延长而显著增大（P<0.05）；蛋白质泄漏量在CGDP处理前10 min几乎无变化，继续延长处理时间，蛋白质泄漏量增加，但差异不显著。处理时间为20 min时，核酸泄漏量和蛋白质泄漏量的增加量分别为对照组的40%和9%，表明Fusarium solani细胞膜出现了损伤或破碎。图5也证明了这一结果，即未处理的Fusarium solani孢子活性较高，均未被PI染色剂染色，而处理后的Fusarium solani孢子均出现可见荧光，且随着CGDP处理时间的延长，荧光强度愈加明显。

SEM图显示了CGDP处理对Fusarium solani孢子形态的影响，图5-G为未经CGDP处理的孢子形态，图5-H和I分别为经CGDP处理15和30 min的孢子形态图。由图5-G可以看出，未经CGDP处理的Fusarium solani孢子呈规则的镰刀状，且表面光滑、内部饱满、有3条不明显的棱膜；CGDP处理15 min后，Fusarium solani孢子形态发生明显变化，孢子表面变得粗糙，且内部发生皱缩，3条棱膜开始变得明显。当CGDP处理时间延长至30 min时，孢子表面愈发粗糙，且出现明显的破损，胞内物质发生泄漏，3条棱膜也可明显地观察到。此外，对比图5-G、H、I可明显观察到，随着处理时间的延长，等离子体对Fusarium solani孢子形态的破坏加重。

图5 CGDP处理Fusarium solani孢子PI染色图和SEM图Fig.5 PI staining and SEM images of CGDP-treated Fusarium solani spores

2.7 模型拟合分析

采用3种常见的微生物致死模型Linear模型、Weibull模型和Log-Logistic模型，分别对不同电压下，CGDP处理过程中，Fusarium solani孢子随处理时间变化的失活曲线进行拟合，拟合参数如表5所示。Linear模型经常被用来反映杀菌过程中，微生物存活数随处理时间变化的关系。500～580 V不同电压下，CGDP处理Fusarium solani失活曲线决定系数（R2）分别为0.722 3、0.464 0、0.754 1、0.736 0和0.775 5，决定系数较低，表明CGDP处理对Fusarium solani的失活过程不符合Linear模型。同时，CGDP处理过程中产生的活性粒子对Fusarium solani孢子致死效应存在差异，导致在整个过程中致死效率不相同。因此，Linear模型不适用于描述CGDP处理条件下微生物的致死规律。

运用另外2种常见的微生物致死模型（Weibull、Log-Logistic模型），进行CGDP处理过程中失活曲线的拟合。不同电压下，2种拟合方程决定系数均高于0.823 7（表5），表明这2种模型可较好地拟合CGDP对Fusarium solani孢子失活曲线。

表5 3种模型拟合CGDP杀灭Fusarium solani 孢子动力学曲线参数Table 5 Parameters of the kinetic curves for CGDP killing of Fusarium solani spores fitted by the three models

为了衡量实测值与预测值之间的差异，以同一模型中实测值为横坐标，预测值为纵坐标作图，并进行线性拟合得到决定系数（R2）。实测值与预测值越接近，拟合曲线斜率越接近1。由图6可知，CGDP处理Fusarium solani实测值与3种模型预测值的关系曲线斜率存在一定差异。其中Linear、Log-Logistic模型关系曲线斜率相对较低，且截距较大，Weibull关系曲线斜率为0.893 1，较接近1。由表6可知，相比于其他两种 模 型，Weibull模 型 的Af、Bf和R2更 接 近1，并 且RMSE较小，表明该模型可靠性高于其他模型。因此，在3个模型的整体比较中，Weibull模型能更好地拟合CGDP处理过程中Fusarium solani的杀灭动力学曲线。

图6 CGDP处理对Fusarium solani杀菌效果实测值与预测值相关性图Fig.6 Correlation between measured and predicted values of the fungicidal effect of CGDP treatment on Fusarium solani

表6 3种模型评价参数的比较Table 6 Comparison of the evaluation parameters of the three models

3 讨论

3.1 CGDP对Fusarium solani杀菌效果的影响及影响因素

在等离子体中，一般认为高能电子、带电粒子、紫外线、氧自由基等物质与微生物的灭活有关。本试验结果表明，随着CGDP电压的增加，杀菌效果逐渐提高。同时，CGDP处理过程中的活性粒子（·OH、H2O2和NO3-）浓度随处理时间的延长而逐渐增大。这与Liu等［21］在研究接触辉光放电产生的光发射特性和自由基时发现的现象相似，即当施加电压超过450 V时，自由基的强度随外加电压的增加而增加。其原因是当施加电压较低时，电子能量不足以活化更多水分子，使阳极尖端产生持续的活化粒子。本试验还表明，使用自由基清除剂抗坏血酸后，杀菌效果明显降低。黄明明［22］研究等离子体对添加抗坏血酸沙门氏菌的杀菌效果时发现，随着抗坏血酸的添加，沙门氏菌对等离子体的抗性增强。因此，推测CGDP过程中产生的活性粒子是杀菌的主要因素之一。对于高浓度的孢子，CGDP杀灭低浓度孢子的效率较大（图4），在滑弧放电等离子体对大肠杆菌的灭菌效果研究中发现，穿透效应是细菌失活的主要因素之一［23］。这可能是因为孢子浓度较高时，CGDP处理过程中产生的高能离子不足以持续穿过细胞壁或细胞膜，破坏胞内电解质，促使细胞死亡。此时杀菌作用可能主要来自活性氧（ reactive oxygen species，ROS）的氧化作用，而高速粒子的穿透效应可以忽略不计。

3.2 CGDP对Fusarium solani生理指标及细胞膜的影响

CGDP处理对Fusarium solani孢子生长及细胞膜完整性测定结果表明，随着处理时间的延长，孢子的生长受到明显的抑制。SEM和PI染色结果也证明了这一点，经CGDP处理后的孢子形态发生明显变化，表面粗糙，可以观察到严重破损现象，PI染色荧光强度也大幅度提高，这与李兆杰等［24］的研究一致。这可能是由等离子体中正负离子在微生物表面产生的剪切力大于其细胞膜表面张力，激活细胞表面刻蚀效应所致［25］。通常，消毒产品中，乳酸分子的电离可以使细胞膜渗透性改变从而破坏底物。CGDP过程中观察到溶液pH值由7.07降至4.66的酸化，可能导致类似的失活模式。然而等离子体引起的酸度增加并未被确定是造成细胞死亡的真正原因，Korachi等［26］通过观察CGDP处理后的胞内物质，发现活性粒子是造成DNA裂解导致细胞凋亡的真正原因。Kim等［27］研究大气压等离子体射流（atmospheric pressure plasma jet，APPJ）对孢子的灭活机制时也表明，ROS等活性物质是导致细胞凋亡的主要因素。

3.3 CGDP杀菌动力学模型

通过对杀菌效果和电压强度关系的分析，得到CGDP处理Fusarium solani的动力学特征与Weibull模型拟合程度最高（R2=0.924 2），更符合CGDP杀菌过程中微生物致死规律。这与王英［28］关于低温等离子体杀灭苹果汁中耐高渗酵母的结果一致。但该模型是否适用于等离子体杀灭其他微生物动力学有待进一步深入研究。

4 结论

本研究结果表明，CGDP能够有效杀灭Fusarium solani孢子。升高电压、延长处理时间和降低孢子初始浓度均能够提高杀菌效果；当CGDP处理20 min时，电压从500 V升高到580 V，Fusarium solani（2×106CFU·mL-1）菌落存活数减少6.05 lg（CFU·mL-1）；在540 V时，CGDP对孢子萌发率、菌丝生长量及菌落直径的抑制作用均随处理时间的延长而增大，处理时间为25 min时，抑制率达到100%；孢内核酸和蛋白质的渗漏量也随处理时间的延长而增大，与0 min相比，处理时间为25 min时，分别增加了48%和13.6%；模型拟合结果表明，Weibull模型符合CGDP处理对Fusarium solani的杀菌动力学曲线。