番茄SlJAZ11的表达分析及互作蛋白的筛选与验证

高苗苗 郭鑫 朱寿松 黄思源 李建君 庞春娜 陈银华 ， 于晓惠 ，

（1海南大学，海南省热带生物资源可持续利用重点实验室，海南 海口 570228；2海南大学热带作物学院，海南 海口 570228；3中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南 海口 571101）

茉莉酸（jasmonate acid，JA）参与植物信号传递，影响种子萌发、根系生长、向重力性、毛状体形成、胚胎发育、幼苗发育、块茎形成、叶片运动、果实成熟和叶片衰老等，还影响酚类化合物的积累［1］。此外，茉莉酸能与其他植物激素共同调节植物的生理过程，包括水杨酸（salicylic acid，SA）、赤霉素（gibberellin，GA）等［2］。茉莉酸除可调节植物生长发育外，还可改善和提高植物对胁迫环境的耐受性［3-4］。SA和JA信号之间的相互作用可以进一步调控植物防御反应，形成针对多种病原体的强大植物免疫系统［5］。

在茉莉酸途径中有3个重要的组分，分别是受体、抑制子和下游的转录因子。含ZIM 结构域的茉莉酸（jasmonate ZIM-domain，JAZ）是JA途径的抑制子，是下游转录因子MYC2的抑制剂和SCFCOI1（Skp1-Cul1-F-box proteinCORONATINEINSENSITIVE1）复合体的靶点［6］。JAZs是仅存在于植物中的TIFY超家族中的一个亚家族［7］，含有3个保守结构域，分别为ZIM（Zinc-inflorescence meristem）、NT和JAS结构域［8-10］。已有研究表明，JAZ在番茄中有26个家族成员，拟南芥有13个、水稻有15个［11］、玉米有23个［12］。JAZ主要通过与下游不同的转录因子互作来实现不同的生理作用。当植物体内茉莉酸含量较低时，JAZ蛋白和其他共抑制子如转录共抑制因子（groucho∕tup1-type co-repressor，TPL）结合为组成型蛋白，与转录因子MYC2结合从而抑制早期茉莉酸应答基因的表达［13-15］。当植物受到外界胁迫时，体内茉莉酸含量上升，在JAR1酶的催化下与异亮氨酸（Ile）形成复合物茉莉酸-异亮氨酸（3R，7S-jasmonoic acid-isoleucine，JA-Ile），其 与 茉 莉 酸 的 受 体COI1（CORONATINE INSENSITIVE 1）结合后在复合物SCFCOI1作用下使JAZ蛋白泛素化，释放出MYC2，从而开始早期茉莉酸应答基因的转录过程。

番茄（Solanum lycopersicum）是我国重要的栽培蔬菜之一。随着番茄种植产业的不断发展与扩大，番茄种植过程中出现的问题越来越突出，特别是各种传染性病害已成为制约番茄产业发展的重要原因之一。据调查，在我国危害番茄的病害约有40多种，如烟草花叶病毒、青枯病、细菌性斑点病、白粉病等［16］。细菌性斑点病也称叶斑病，主要危害叶片，该病的致病病原菌为丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000，PstDC3000）。PstDC3000常被用于研究病原菌与植物的互作［17］，为揭示番茄和细菌之间的相互作用原理提供了便利。

在番茄中，目前已知有26个JAZ成员［11］，其中SlJAZ11的功能研究相对较少，仅在衰老、非生物胁迫方面有相关报道［18］。现有研究表明，SIJAZs在不同程度上参与对PstDC3000侵染的早期响应，其中SlJAZ9∕10∕11在诱导后1 h表达量有显著性上调［19］，说明SlJAZ11受到病原菌的强烈诱导。进一步探究SlJAZ11响应抗病相关激素以及病原菌胁迫的调控机制，对培育番茄抗病品种具有十分重要的意义。鉴于此，本研究以SlJAZ11为对象，探索其在抗病相关激素和PstDC3000诱导下的表达特征，并对SlJAZ11的互作蛋白进行筛选及验证，以期为阐明SlJAZ11的功能与作用机制奠定良好的分子基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 本研究所用的野生型番茄品种AC（Solanum lycopersicMill.cv Ailsa Craig，AC）由海南省热带生物资源可持续利用重点实验室提供，种植于温室中，光照∕黑暗条件为16 h∕8 h，26 ℃。烟草为本氏烟由海南省热带生物资源可持续利用重点实验室提供，空气湿度70%，光照∕黑暗条件为14 h∕10 h，25 ℃。

1.1.2 菌株与载体 丁香假单胞菌番茄致病变种PstDC3000、酵母菌株AH109（NRR00030，Clontech，上海）、Y2H（MF2351，Clontech，上海）、大肠杆菌DH5α（DL1001S，唯地生物，上海），农杆菌GV3101（pSoupp19）（AC1001S，唯地生物，上海）。

酵母双 杂 交质粒pGADT7、pGBKT7、pGADT7-largeT、pGBKT7-p53、pGBKT7-laminC、pNC-BiFCENC、pNC-BiFC-ECC［20］和pCAMBIA1300-35S-GFP均由海南大学热带生物资源可持续利用生物重点实验室提供。

1.1.3 试剂与药品 主要药品与试剂：多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN，北京），TRIzol试剂、限制性内切酶、反转录试剂盒（Thermo Fisher，美国），T4 DNA连接酶（EL0011，Invitrogen，上海），质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、2×A9 PCR MasteMix（艾德莱，北京），同源重组试剂盒（新赛美，苏州），引物由北京擎科生物科技有限公司合成（表1）。100 mg·L-1氨苄青霉素、100 mg·L-1庆大霉素、50 mg·L-1卡那抗生素、25 mg·L-1利福平均由学校平台莱博科技购入并保存。

所用溶液及培养基：酵母选择营养缺陷型培养基（minimal synthetical defined medium，SD）∕-Trp筛选培养基；SD∕-Leu∕-Trp固体和液体筛选培养基；SD∕-Trp+X-α-Gal（5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside）（20 mg·L-1）+金担子素（aureobasidin A， AbA）固体筛选培养基；SD∕-Trp+X-α-Gal（20 mg·L-1）固体筛选培养基；硅酸盐细菌液体培养基（yeast peptone dextrose adenine medium，YPDA）液体和固体培养基；SD∕-Trp-Leu-His-Ade固体培养基；2×YPDA培养液；0.5×YPDA培养液；LB液体培养基；X-α-Gal（北京泛基诺科技公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 SlJAZ11蛋白生物信息学分析 运用PSIPRED（http：∕∕bioinf.cs.ucl.ac.uk∕psipred）网站分析SlJAZ11蛋 白 的 二 级 结 构；通 过SWISS-MODEL（https：∕∕swissmodel.expasy.org∕interactive）网站预测其蛋白三级结构；应用NetPhos 3.1 Server 和 NetNGlyc 1.0 Server分别预测蛋白的磷酸化和糖基化位点；利用SignalP3.0 Server（http：∕∕www.cbs.dtu.dk∕services∕Signal P）在线工具预测信号肽；利用HMM方法（http：∕∕www.cbs.dtu.dk∕services∕TMHMM∕）对SlJAZ11的蛋白质跨膜区域进行预测。

1.2.2 SlJAZ11的亚细胞定位 构建植物表达载体pCAMBIA-35s-SlJAZ11-GFP，与空载pCAMBIA1300-35S-GFP分别转入农杆菌感受态GV3101中。挑选生长周期为30 d左右的烟草，将菌液（OD600值0.8）注射于适龄烟草叶片背面［21］，注射过的植株于21 ℃左右培养48 h，在TCS SP8激光共聚焦显微镜（Lecia，德国）下观察注射过的区域有无荧光。

1.2.3 植物材料处理 选取生长期约为30 d且生长状态一致的约野生型番茄植株幼苗，采用2 mmol·L-1SA、100 µmol·L-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）以及OD600值0.2的PstDC3000喷施法处理番茄叶片背部，分别摘取0、0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、48和72 h的番茄叶片，放置在-80 ℃条件下备用。

1.2.4 RNA的提取 经过处理后取下的番茄叶片经液氮速冻后用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取其RNA，并反转录为cDNA。每个样品、每个时间点均设置3个生物学重复。

1.2.5 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR） qRT-PCR程序按SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa，北京）说明操作。Sltublin（Solyc10g086760）作为内参基因，通过2‒∆∆CT法［22］计算，结果利用GraphPad 6.02［23］软件绘图。

1.2.6 酵母双杂交载体构建 根据基因编码区（coding sequence，CDS）序列设计引物（表1），以野生型番茄AC的cDNA为模板，用高保真酶A9进行目的基因CDS序列的扩增。根据所选酶切位点，使用NEB公司限制性核酸内切酶，37 ℃、6 h条件下对载体和片段分别进行双酶切。纯化回收载体和目的片段，用T4连接酶连接，并转化大肠杆菌DH5α。37 ℃过夜培养后，挑取单菌落进行菌落PCR检测，阳性克隆送广州华大基因公司测序，获得目标载体。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.7 自激活检测 将pGBKT7-SlJAZ11、pGBKT7-SlENT质粒分别与pGADT7共转入酵母Y2H或AH109菌株，并涂布于SD∕-Trp∕-Leu缺陷培养基平板上，28 ℃恒温培养3～5 d；挑取SD∕-Trp∕-Leu平板上生长较好的酵母单菌落，28 ℃、240 r·min-1条件下过夜培养。阳性对照为pGBKT7-53+pGADT7-T，阴性对照为pGBKT7-Lam+pGADT7-T。分别将菌液稀释10×、100×、1 000×，滴在SD∕-Trp∕-Leu+X-a-Gal、SD∕-Trp、SD∕-Trp+X-a-Gal、SD∕-Trp+X-a-Gal+AbA或SD∕-Trp∕ -Leu、SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade和SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕ -Ade+X-a-Gal固体筛选培养基上，28 ℃条件下培养2～3 d，观察其是否有自激活。

1.2.8 cDNA文库筛选互作蛋白 用4～5 mL含有pGBKT7-SlJAZ11诱饵载体的酵母菌液和1 mL AD文库菌液混合，低转速培养出现三叶草形状结合子后，均匀涂于SD∕-Trp∕-Leu∕-His+ABA的缺陷型平板上，30 ℃培养7 d，将SD∕-Trp∕-Leu∕-His+AbA板上长势较好的单菌落 转 移 到筛 选 度 更强 的SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade∕ +X-a-Gal平板上进一步筛选，随后将蓝色单克隆进行进一步的测序分析和点对点验证。挑取阳性酵母单菌落为模板，pGADT7通用引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送广州华大基因公司测序。测序结果在Phytozome（https：∕∕phytozome-next.jgi.doe.gov∕）进行BLAST序列比对，进一步明确这些基因的功能。

1.2.9 酵母双杂交验证 将候选蛋白构建至诱饵载体pGBKT7，按照上述方式验证其是否具有自激活活性，将pGBKT7-SlENT和pGBKT7-SlOOLG分 别 与pGADT7-SlJAZ11共转至酵母菌株AH109，涂布在SD∕-Trp∕-Leu平板上，30 ℃培养4 d后观察其生长情况。挑取平板上生长较好的酵母单菌落，28 ℃、240 r·min-1条件下过夜培养。阳性对照为pGBKT7-53+pGADT7-T，阴性对照为pGBKT7-Lam+pGADT7-T。分别将菌液稀释10×、100×、1 000×，滴在SD∕-Trp∕-Leu、SD∕-Trp∕ -Leu∕-His∕-Ade、SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade+X-a-Gal固体培养基上，验证互作关系。

1.2.10 双分子荧光互补实验验证互作关系 采用你行（Nimble Cloning，NC）［22］克隆方法构建双分子荧光互补试验（bimolecular fluorescence complementation experiment，BiFC）载体（pNC-BiFC-ENC-SlJAZ11、pNCBiFC-ECC-SlENT），设计引物时采用Nimble Cloning通用引物设计原则，目标基因两端加上通用接头（上游接头5´-agtggtctctgtccagtcct-3´，5´-ggtctcagcagaccacaagt-3´）。使用高保真酶A9进行目的片段的扩增，将获得的PCR产物按照同源重组试剂盒说明书要求进行连接（50 ℃、30 min），取5 µL反应产物转化DH5α感受态细胞。37 ℃过夜培养后挑选单克隆进行菌落PCR验证，阳性克隆送广州华大基因公司测序验证。将含有目的基因的载体与空载分别转入农杆菌GV3101（pSoup-p19）中，挑取阳性单克隆至含有相应抗生素的LB培养基中28 ℃、200 r·min-1条件下摇菌至OD600为0.8，用侵染液［MgCl2+吗啉乙磺酸（MES monohydrate，MES）+乙酰丁香酮（acetosyringone，As）］清洗并悬浮农杆菌菌体。等体积混合两种含有不同质粒的菌液，室温静置2 h，将菌液注射于适龄（30 d）烟草叶片背面，注射过的植株于21 ℃左右培养48 h，在confocal显微镜下检测荧光信号。

2 结果与分析

2.1 SlJAZ11蛋白理化性质分析

利用PSIPRED和SWISS-MODEL在线网站分别对蛋白二级和三级结构进行分析，结果表明，SlJAZ11有5处螺旋结构，其中23.62% α-螺旋（Helix）、3.15% β-折叠（Sheet）、58.27%无规则卷曲（Coil）（图1-A、B）；利用TMHMM在线软件预测SlJAZ11蛋白跨膜结构，结果表明SlJAZ11蛋白不存在跨膜结构域，是非分泌蛋白（图1-C）；Signal IP网站预测结果显示该蛋白没有信号肽，不具备信号识别功能（图1-D）；利用NetPhos在线网站预测SlJAZ11蛋白有14个磷酸化位点（丝氨酸13个、苏氨酸0个、酪氨酸1个）（图1-E）；有3个糖基化位点（图1-F）。

图1 SlJAZ11蛋白的生物信息学分析Fig.1 Bioinformatics analysis of SlJAZ11 protein

2.2 SlJAZ11的亚细胞定位

将重组质粒pCAMBIA1300-35S-SlJAZ11-GFP和空载质粒pCAMBIA1300-35S-GFP分别注射于烟草叶片背部，培养48 h后在激光共聚焦显微镜下观察荧光信号（图2）。红色荧光为细胞核定位荧光标记，绿色荧光为SlJAZ11-GFP融合蛋白发出的荧光。结果表明，转入空载质粒的对照组烟草表皮细胞中均分布较强的绿色荧光信号；而融合蛋白的荧光信号分布于细胞核和细胞膜中，并且红色荧光与绿色荧光基本重合，呈现出黄色和绿色的光，由此可知SlJAZ11蛋白定位于细胞核和细胞膜。

图2 SlJAZ11亚细胞定位分析Fig.2 SlJAZ11 subcellular localization analysis

2.3 JA、SA和DC3000诱导下的SlJAZ11表达量分析

茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）、丁香假单胞菌（PstDC3000）等激素和病原菌、环境在植物应对各种胁迫过程中发挥着重要的调节作用。利用MeJA、SA、PstDC3000处理番茄叶片，通过qRT-PCR技术分析SlJAZ11基因的表达水平变化，结果如图3所示。在MeJA、SA、PstDC3000处理下，0.5 h后SlJAZ11基因的表达量均有显著上调，为0 h表达量的200倍左右。在PstDC3000侵染的不同时间点的叶片中，SlJAZ11基因的转录水平呈先上升后下降再上升的变化趋势。MeJA和SA诱导后SlJAZ11基因的表达趋势基本一致，SA处理后6 h后表达量有明显的上调，约为0 h表达量的400倍。初步说明SlJAZ11能响应MeJA、SA和PstDC3000诱导的途径，能够被抗病相关激素（MeJA、SA）、病原菌（PstDC3000）所诱导。

图3 JA、SA和DC3000诱导下SlJAZ11表达分析Fig.3 Expression analysis of SlJAZ11 induced by JA， SA and DC3000

2.4 SlJAZ11酵母双杂交载体构建

本研究采用酵母双杂交技术筛选与SlJAZ11互作的蛋白。以野生型番茄AC的cDNA为模板，根据番茄SlJAZ11基因编码区引物扩增得到一条384 bp的目的片段，随后进行酶切、连接和菌落PCR。由图4可知，电泳特异性强，与预期结果一致。菌落PCR检测的阳性克隆送广州华大基因公司测序，获得载体pGBKT7-SlJAZ11和pGADT7-SlJAZ11。

图4 SlJAZ11酵母双杂交载体构建Fig.4 SlJAZ11 yeast two-hybrid vector construction

2.5 SlJAZ11自激活检测

将测序成功的载体pGBKT7-SlJAZ11与pGADT7空载共转入酵母菌株Y2H中，然后涂布于SD∕-Trp∕ -Leu平板上，28 ℃倒置培养2～3 d后挑取单克隆摇菌点板，结果如图5所示。阳性对照（pGBKT7-53+pGADT7-T），阴性对照（pGBKT7-Lam+pGADT7-T）在SD∕-Trp∕ -Leu+X-a-Gal平板上均存在克隆（阳性对照为蓝色克隆，阴性对照为白色克隆），BD-空载（pGBKT7）和pGBKT7-SlJAZ11在SD∕-Trp，SD∕-Trp+X-a-Gal，SD∕ -Trp+X-a-Gal+AbA存在克隆，且克隆颜色为白色。说明SlJAZ11不存在自激活现象，可进行后续筛选试验。

图5 SlJAZ11自激活检测Fig.5 SlJAZ11 self-activation detection

2.6 cDNA文库筛选互作蛋白

利用番茄cDNA文库筛选与SlJAZ11互作的蛋白，通过计算1 000×DDO平板的单克隆数得出AD文库转化效 率>2×107cell·mL，共有100个 单菌 落可 在SD∕ -Trp∕-Leu∕-His+AbA上长出，将长势较好的单菌落转移到筛选度更强的SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade+X-a-Gal平板上，共有40个单菌落变蓝。测序结果共得到14个可能与SlJAZ11相互作用的蛋白（表2），其中包括与温度相关的热休克蛋白（heat shock protein，HSP）［1］，与活性氧产生相关的胚芽素样蛋白亚家族3成员（oxalate oxidase-like germin 171，OOLG），调控HSP40的分子伴侣蛋白（chaperone protein dnaJ，CPD）［24］，与植物免疫相关的含有EMSY-N终端结构域的蛋白（EMSY N TERMINUS，ENT）［25］等，涉及多种生化过程。说明SlJAZ11可能参与调控多个复杂的通路。选择SlOOLG和SlENT来探究SlJAZ11在抗病过程中可能的调控通路，构建酵母双杂交载体，并对其与SlJAZ11的互作关系进行进一步研究。

表2 酵母双杂交文库筛选出与SlJAZ11互作的蛋白Table 2 Yeast two-hybrid cDNA library screening for possible interactiong proteins of SlJAZ11

2.7 酵母双杂交点对点验证

分别将SlENT和SlOOLG进行自激活和点对点验证来进一步确认SlJAZ11与SlENT和SlOOLG之间的互作关系。

2.7.1 自激活检测 将测序成功的载体pGBKT7-SlENT和pGBKT7-SlOOLG与pGADT7空载共转入酵母菌株AH109中，检测SlENT和SlOOLG是否具有自激活活性，结果如图6所示。阳性对照（pGBKT7-53+pGADT7-T）和阴性对照（pGBKT7-Lam+pGADT7-T）在SD∕-Trp∕-Leu平 板 上 均 有 白 色 克 隆，在SD∕-Trp∕ -Leu∕-His∕-Ade，SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade∕+X-a-Gal固体培养基只有阳性对照存在克隆且变蓝，而试验组（pGBKT7-SlENT和pGBKT7-SlOOLG）只 有 在SD∕ -Trp∕-Leu上有 克 隆，SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade，SD∕-Trp∕ -Leu∕-His∕-Ade∕+X-a-Gal未存在克隆，说明SlENT和SlOOLG不具有自激活活性，可以进行后续的酵母双杂交试验。

图6 SlENT和SlOOLG自激活检测Fig.6 SlENT and SlOOLG self-activation assay

2.7.2 SlENT与SlJAZ11点对点验证 利用酵母双杂交技术对候选蛋白与SlJAZ11进行互作验证，结果如图所示（图7）。阳性对照（pGBKT7-53+pGADT7-T）和阴性对照（pGBKT7-Lam+pGADT7-T）在SD∕-Trp∕-Leu上均有白色克隆，且在SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade，SD∕ -Trp∕-Leu∕-His∕-Ade∕+X-a-Gal固体培养基上只有阳性对照存在克隆且变蓝。而试验组（AD-SlJAZ11∕ BD-SlOOLG和AD-SlOOLG∕BD-SlJAZ11）只 有 在SD∕-Trp∕ -Leu上有白色克隆，在SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade，SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade∕+X-a-Gal固体培养基上与阴性对照一致。试验组（AD-SlJAZ11∕BD-SlENT）在SD∕-Trp∕-Leu，SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade，SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕-Ade∕+X-a-Gal上均存在克隆且在SD∕-Trp∕-Leu∕-His∕ -Ade∕+X-a-Gal固体培养基上变蓝。试验结果初步说明SlENT与SlJAZ11存在互作关系。

图7 SlJAZ11与SlENT或SlOOLG点对点验证互作Fig.7 Identification of the interaction between SlJAZ11 and SlENT or SlOOLG by point-to-point assay

2.8 SlENT与SlJAZ11双分子荧光互补（bimolecular fluorescene complementation, BIFC）验证

酵母双杂交存在一定的假阳性可能，因此进一步通过BIFC验证SlENT与SlJAZ11的互作关系，利用Nimble Cloning构 建BIFC载 体pNC-ENC-SlJAZ11和pNC-ECC-SlENT，分别转化农杆菌GV3101（pSoupp19），将含有两个载体的菌液1∶1混匀后，注射到适龄的烟草中，48 h后显微观察（图8）。由结果可知，阴性对照（cEYFP+nEYFP∕SlJAZ11-nEYFP+cEYFP）没有检测到荧光信号，试验组（SlJAZ11-nEYFP+SlENT-cEYFP）可以看到黄色荧光信号，并且荧光信号存在于细胞核中，证明SlJAZ11和SlENT存在互作关系。

图8 BiFC验证SlJAZ11和 SlENT互作关系Fig.8 BiFC assays for identifying the interaction between SlJAZ11 and SlENT

2.9 SlENT蛋白的生物信息学分析

利用PSIPRED和SWISS-MODEL在线网站分别对蛋白二级和三级结构进行分析，结果表明，三级结构以1utu.1.B为 原 型SlENT有17处 螺 旋 结 构，其 中26.85% α-螺旋（Helix）、4.63% β-折叠（Sheet）、65.65%无规则卷曲（Coil）（图9-A、B）；利用TMHMM在线软件预测SlENT蛋白跨膜结构，结果表明SlENT蛋白不存在跨膜结构域，是非分泌蛋白（图9-C）；Signal IP 网站预测结果显示该蛋白没有信号肽，不具备信号识别功能（图9-D）；利用NetPhos在线网站预测SlENT蛋白有37个磷酸化位点（丝氨酸28个、苏氨酸7个、酪氨酸2个）（图9-E）；有1个糖基化位点（图9-F）。

图9 SlENT蛋白的生物信息学分析Fig.9 Bioinformatics analysis of SlENT protein

2.1 0 JA、SA和DC3000诱导下SlENT表达分析

前人研究表明，ENT参与了植物的免疫［25］，本试验对其在PstDC3000、MeJA、SA处理下的表达情况进行分析，初步探究SlENT的生物学功能，发现除2 h，SlENT被PstDC3000显著诱导下调表达，且在0.25 h和4 h下调最为明显；SlENT被JA诱导上调表达，且在6 h时上调最为显著；而在SA处理后，SlENT的表达变化不明显，仅在1 h时显著下调表达。初步证明SlENT基因响应MeJA的诱导，能被SA和PstDC3000显著抑制（图10）。

图10 JA、SA和DC3000诱导下SlENT表达量分析Fig.10 Expression analysis of SlENT under biotic and abiotic stresses

3 讨论

JAZ属于茉莉酸信号途径的抑制子，因其ZIM结构域中的保守序列TIFYXG而被命名［26］。茉莉酸ZIM结构域（JAZ）抑制子通过负调节茉莉酸盐的信号转导，从而调节植物发育和免疫力。在植物的生长发育过程中，JAZ主要通过与不同的转录因子互作来实现不同的生理作用，JAZ1和JAZ4可以与ICE1互作，可以调控植物的抗寒性［27］。研究表明，JAZ和DELLA的互作可以解除对MYC2和PIF5的抑制，从而激活下游基因的表达，促进植物下胚轴的生长，同时还能增强根对茉莉酸的耐受性，提高植物的抗性［21］。还有研究表明，拟南芥中存在1个ENT基因家族AtEML（AtEML1、AtEML2、AtEML3和AtEML4）。AtEML1和AtEML2和AtEML4有 助 于RPP7介 导 的 植 物 免 疫［25］。目 前SlJAZ11在衰老和非生物胁迫中的研究较多［18］，但目前鲜有关于SlJAZ11抗病的报道。本研究结果显示，SlJAZ11和SlENT存在互作关系，通过蛋白序列比对发现，SlENT与AtENT两者同源性较高，推测SlJAZ11可能通过与SlENT互作来调节植物免疫。

JA和SA是植物防御和发育所必需的激素［28］，PstDC3000携带大量潜在毒力因子，其结构类似于植物激素茉莉酸［29］。Du等［30］和Pauwels等［31］研究发现外源喷施JA后能够促进JAZ1、JAZ2、JAZ3、JAZ5、JAZ6基因的表达，认为JA激素能够诱导JAZs基因的表达。Ryan等［32］根据JA反应的表达时间，将相关的防御基因分为“早期”基因和“晚期”基因。本试验结果表明，MeJA喷施后SlJAZ11和SlENT表达水平在早期呈显著上调趋势，与上述前人研究结果一致，说明SlJAZ11和SlENT基因响应JA的早期调控。SlJAZ11和SlENT在MeJA的作用下表达水平均上调，因此猜测SlJAZ11和SlENT基因可能在JA信号调控的植物免疫反应中发挥作用。

本研究结果表明，SA喷施后SlJAZ11基因的表达量呈先上升后下降再上升的趋势，从整体表达水平上看，SlJAZ11的表达量升高，表明该基因的表达受到SA的诱导；也发现在PstDC3000处理后，SlJAZ11表达水平呈显著上调趋势；在PstDC3000和SA处理后SlENT表达量被抑制。一般情况下，SA和JA信号通路出现相互拮抗的作用［33］，在本研究中SA、JA处理后SlJAZ11相对表达水平变化趋势相反证实了SA与JA间的拮抗关系，SlENT验证了SA与JA间的拮抗关系。SlJAZ11对PstDC3000敏感，而SlENT对PstDC3000不敏感，说明SlJAZ11和SlENT影响Pst DC3000侵染的信号途径有差异。目前尚不明确SlJAZ11能否与其互作蛋白SlENT共同调控植物的免疫性，后续工作可以利用免疫共沉淀技术进一步阐明SlJAZ11和SlENT之间的互作关系，以明确SlJAZ11和SlENT在植物免疫过程中的功能，为进一步阐明SlJAZ11功能研究奠定基础。

4 结论

本研究通过烟草亚细胞定位分析发现，SlJAZ11在细胞膜和细胞核中均有表达，说明SlJAZ11能在细胞膜和细胞核中发挥功能。对野生型番茄植株进行抗病相关激素（MeJA、SA）和病原菌（Pst DC3000）处理后，发现SlJAZ11能响应MeJA、SA和Pst DC3000的诱导，且其互作蛋白SlENT也能响应MeJA的诱导。通过酵母双杂交技术，筛选到14个可能与SlJAZ11互作的候选蛋白，点对点验证SlJAZ11与SlENT之间存在互作。进一步通过双分子荧光互补技术，证明SlJAZ11和SlENT存在互作关系。