线粒体异常与卵巢储备功能减退的研究进展

沈浩玥，韩乐，包文秀，曾慧芳，赵志梅

(天津中医药大学第一附属医院 国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300380)

卵巢储备功能指卵巢内存留卵泡数量和卵母细胞质量的潜能，受年龄、遗传、环境等因素的影响，是影响生殖结局最重要的因素[1]。卵巢储备功能减退(DOR)是卵巢功能下降的早期阶段，指卵巢产生卵母细胞数量和质量下降，伴有性激素缺乏，主要表现为女性潜在生育力减退、月经不调、闭经等，是女性常见内分泌疾病[2]。近年DOR发病率呈逐年上升趋势，但发病机制尚不明确，目前推测与遗传、免疫、环境等多种因素有关。

线粒体是真核细胞中的双细胞膜细胞器，参与许多基本的细胞功能调节。线粒体功能障碍可以直接或间接影响线粒体呼吸链和氧化磷酸化等一系列重要的细胞功能，造成细胞衰老和凋亡，从而导致多种疾病[3]。有假说提出，线粒体活性的调节是决定生殖能力的关键因素[4]。研究发现线粒体功能障碍可造成卵母细胞及其周围卵丘颗粒细胞的功能障碍和凋亡，导致卵泡闭锁甚至衰竭，引起卵巢储备功能下降，提示线粒体异常与DOR的发生和发展关系密切[5-6]。本文就卵泡发育过程中卵母细胞及其周围颗粒细胞线粒体数量、结构、分布及功能改变导致DOR的机制及通过调控线粒体延缓卵巢衰老展开综述。

一、线粒体异常与DOR

(一)线粒体数量减少

不同细胞中线粒体的数量不同，一般取决于细胞类型和细胞代谢水平。卵母细胞在发生过程中不断进行减数分裂，需消耗大量腺苷三磷酸(ATP)，能量代谢活性较高，是线粒体数量最为丰富的细胞[7]。随着卵母细胞成熟，细胞代谢水平及不同阶段卵母细胞中线粒体数量也发生改变[8]。研究表明，和成熟小鼠卵母细胞中线粒体数目相比，生育力降低的老年小鼠卵母细胞中线粒体数目显著下降。在退化的卵母细胞中，可观察到卵母细胞线粒体的缺失[9]。另有实验表明，高龄女性颗粒细胞功能下降伴随线粒体数量的缺失，ATP产生能力相对较低[10]。因此，当出现DOR时，会伴随线粒体数量的异常，影响线粒体功能，从而导致卵母细胞、胚胎质量下降。

(二)线粒体形态结构与空间变化

线粒体是双层膜结构的细胞器，内膜向内褶皱形成“嵴”，线粒体嵴上存在许多线粒体基粒，这些基粒可利用呼吸链合成ATP。能量需求不同的细胞，线粒体嵴的数目和形态也不同，一般由含少量管泡状嵴的椭圆形未成熟线粒体，向含大量板层状嵴、具有高代谢活性的长条状成熟线粒体转变[11]。Liu等[12]在透视电子显微镜下观察到<38岁年龄组和≥38岁年龄组女性卵巢颗粒细胞分别有明显嵴线粒体和空泡线粒体两种形态，与年轻女性颗粒细胞相比，高龄女性细胞中空泡、不完整嵴的线粒体占比更高。

线粒体常分布于能量需求高且代谢活跃的区域，线粒体分布不规则是卵母细胞损伤的标志[13]。Tarazona等[14]发现牛卵母细胞中，未成熟卵母细胞线粒体活性很低，呈弥漫性或不明显分布；成熟卵母细胞线粒体活性较高，呈弥漫性或胞质周分布。郭虹敏等[15]发现了小鼠卵母细胞线粒体在卵母细胞成熟过程中经历了重新分布，即线粒体在由颗粒分散状分布变为在细胞核周围聚集分布。因此，通过观察卵母细胞及颗粒细胞线粒体的形态和动态分布，可推测卵母细胞的质量，为DOR的诊断及治疗评估提供依据。

(三)线粒体遗传异常

线粒体拥有其独立的遗传物质，即线粒体DNA(mtDNA)。mtDNA母系遗传，即卵母细胞是线粒体将遗传物质传递到下一代的唯一载体[16]。最近有研究发现了全新的跨代遗传现象，即由mtDNA水平升高的母系遗传为介导，诱导后代个体携带更高拷贝的mtDNA，使后代继承母本的线粒体未折叠蛋白反应，在后代中实现代代遗传[17]，提示mtDNA携带细胞代谢和能量产生的重要遗传信息，是线粒体功能障碍的潜在标志物，可用来衡量卵母细胞发育潜能，评估卵巢储备功能。有研究表明，mtDNA拷贝数变异及结构突变累积可导致线粒体功能障碍和细胞内ATP合成减少，影响卵母细胞的质量，从而影响卵巢储备功能[18]。

1.mtDNA拷贝数异常：卵母细胞中mtDNA数量巨大，成熟卵母细胞含有超过15万份mtDNA，在着床前没有被复制，因此mtDNA拷贝数能较好地反映mtDNA的数量。mtDNA拷贝数减少将引起线粒体数量下降甚至卵母细胞凋亡，使线粒体功能减退，导致卵母细胞因供能不足，无法完成正常生理活动而引起DOR。Benkhalifa等[19]发现退化卵母细胞中mtDNA拷贝数与正常卵母细胞相比有显著性差异，较正常卵母细胞中mtDNA拷贝数少。Dioguardi等[20]研究表明，DOR患者颗粒细胞中mtDNA拷贝数显著降低。Wai等[21]通过在小鼠生殖系发育的不同阶段删除线粒体类核的重要组成部分线粒体转录因子A(Tfam)的一个拷贝，对小鼠mtDNA拷贝数进行遗传操作，发现存在一个mtDNA拷贝数阈值，当线粒体拷贝数大于这一阈值时，胚胎可正常发育；而当小于这一阈值时，则会造成胚胎发育阻滞。以上结论都表明了mtDNA拷贝数在卵母细胞发育中发挥重要的作用，是评价卵母细胞质量及卵巢储备功能的重要指标。临床上可以通过检测卵母细胞及颗粒细胞线粒体中mtDNA的拷贝数来评价卵母细胞质量。

2.mtDNA突变/缺失：由于缺乏组蛋白的保护和mtDNA聚合酶γ的校对能力，且邻近产生大量活性氧(ROS)的电子传递链，处于高氧胁迫环境，相比核染色体，mtDNA更容易受到损伤，发生突变或片段缺失[22]。mtDNA发生突变或缺失的这种致病性变化可导致DNA转录和翻译缺陷，线粒体呼吸链功能受损，从而影响线粒体功能，ATP产生减少，ROS堆积，进一步引起mtDNA的突变或缺失，进入恶性循环，造成卵母细胞与颗粒细胞的衰老和凋亡。其中，4977 bp是线粒体DNA最常见的缺失基因，赵红翠等[23]发现与卵巢储备功能正常者相比，DOR患者卵母细胞内mtDNA 4977 bp缺失率高，二者有显著性差异，推测可能因DOR患者卵巢内环境改变，使卵泡处于相对缺氧的环境，活性氧产生增加，而导致mtRNA 4977 bp缺失。该片段控制着ATP ase6、ATP ase8、NADH脱氢酶亚基3、ND4L、ND4、ND5等线粒体基因核苷酸，可造成mtDNA编码的氧化磷酸化相关蛋白的合成损伤[24]。另外，线粒体SIRT3蛋白能够感知细胞代谢状态并在翻译后改变线粒体蛋白功能，参与壁颗粒细胞与卵丘颗粒细胞代谢。房晓欢等[25]的研究显示，在DOR患者的颗粒细胞中，SIRT3 mRNA和活性蛋白降低。mtDNA片段的缺失与突变，也为探究DOR的分子机制提供了新的思路。

(四)线粒体自噬的异常

线粒体自噬是细胞内稳态的一个关键途径，当线粒体受损时，它们可以被自噬体选择性吞噬并融合到溶酶体中降解，从而维持线粒体种群健康和体内平衡[26]。卵母细胞可通过线粒体自噬清除多余或受损的线粒体，因此线粒体自噬与卵母细胞质量密切相关，直接参与影响卵巢储备功能[27]。Song等[28]研究表明，生殖细胞特异性敲除自噬诱导基因ATG7导致雌性小鼠生育能力低下。ATG7缺失女性的低生育能力是由严重的卵泡丢失引起的，这与人类早发性卵巢功能不全患者相似。这揭示了自噬在调节卵巢原始卵泡保留中的作用，提示自噬相关基因损伤可能是女性DOR的潜在致病因素。Delcour等[29]利用自噬的经典标志LC3将某些基因与溶酶体降解途径连接起来，在ATG7和ATG9A变异体与早发性卵巢功能不全之间建立了功能联系，并证明了变异体ATG7和ATG9A导致自噬体生物合成的减少，从而导致自噬的损伤，对原始卵泡保存和卵巢储备造成了影响。综上，因各种因素损伤的线粒体可以通过多种途径对自身进行降解，但由于基因损伤等因素造成线粒体自噬发生异常时，自噬无法被激活，不能通过负反馈保护卵巢中的卵母细胞及颗粒细胞，影响卵母细胞发育和颗粒细胞的活力，从而使受损的细胞参与到卵巢储备功能下降的进程中。

二、从线粒体角度干预DOR

线粒体异常是引起DOR的重要机制，药物干预或生活方式改善线粒体功能和将功能性线粒体替换到生殖细胞中可作为DOR治疗的新思路。目前的治疗主要包括药物治疗、线粒体移植及生活方式干预等。

(一)药物治疗

在DOR退行性改变的进程中，从线粒体损伤的各个环节入手，用药物改善线粒体功能，延缓卵母细胞的损伤和衰老，是近年来的研究热点。辅酶Q10、白藜芦醇、褪黑素、生长激素、硫酸脱氢表雄酮、α-硫辛酸等都是证实有临床疗效的线粒体营养剂。实验研究表明，在老年动物模型中补充辅酶Q10可以延缓卵巢储备的减退，恢复卵母细胞线粒体基因的表达，提高线粒体的活性[30-31]。年龄相关性卵母细胞质量和数量的下降、卵母细胞特异性基因Pdss2(prenyl diphosphate synthase subunit 2)缺陷动物的卵巢储备减少，可通过饮食给予辅酶Q10来预防。Zhou等[32]的实验研究表明，白藜芦醇可以激活小鼠线粒体选择性有丝分裂吞噬，防止活性氧的产生，有效地防止排卵后卵母细胞在体内老化。褪黑素可以通过增加SIRT-1蛋白表达、ATP含量和自噬来改善线粒体功能，从而最终改善卵母细胞中线粒体的分布；褪黑素及其代谢产物还可以作为自由基清除剂，降低细胞内ROS并增加总抗氧化能力(TAC)，提高卵母细胞的成熟率，改善高龄小鼠卵母细胞的质量[33]。

(二)线粒体移植

近年来，随着显微操作技术的发展，人工线粒体转移技术为治疗DOR提供了一种新的可能，目前主要有胞浆移植、异体体细胞线粒体移植、自体体细胞线粒体移植3种方式[34]。线粒体移植技术旨在确定线粒体的最佳数量和细胞组织来源，在体外和体内应用中诱导细胞重编程或组织修复，从而复制线粒体自然运输过程的各个方面，模仿线粒体的自然转移。但由于实施难度大、涉及到伦理等问题的存在，该技术并未在临床广泛推广[35]。

(三)生活方式干预

日常的不良生活习惯已成为DOR的重要致病因素，从生活方式角度进行干预，改善线粒体功能，进而延缓DOR进程，将成为DOR防治的重要方面。

1.合理饮食，适量运动：随着当今社会物质水平的提高，育龄期女性体质量指数(BMI)值偏高比例逐渐上升，不健康的高热量饮食及吸烟饮酒等生活习惯也会造成内分泌紊乱，影响卵巢储备功能。研究表明，脂肪与游离脂肪酸会在肥胖小鼠的卵母细胞及卵丘细胞堆积，线粒体膜电位及ATP含量下降明显，ROS水平明显升高，影响卵母细胞正常代谢，造成排卵后卵母细胞的老化，从而影响卵巢储备功能[36]。通过锻炼、在饮食中限制卡路里的摄入可显著减少mtDNA的损伤，维持代谢稳态[37]。改善饮食结构，如低盐低脂、多吃蔬菜水果、摄入优质碳水、规律饮食等对于改善卵巢储备功能都有积极影响。另外，运动训练可促进线粒体的生物合成，是激活线粒体功能的有效刺激，经有氧运动干预后，肥胖大鼠部分肿胀线粒体形态结构恢复，膜结构完整，逐步恢复正常线粒体功能[38]；但运动训练应遵循适度原则，过度的运动也会导致线粒体功能受损[39]。

2.调畅情志：现代社会生活节奏快，育龄期女性工作、生活压力大，生活不规律，长期处于紧张焦虑的状态，易影响卵巢功能。葛灵玲等[40]研究表明，DOR患者暴躁、忧郁情绪发生率高于健康女性。研究表明抑郁症患者线粒体异常广泛存在，线粒体数目减少，ATP产生低，mtDNA缺失，形态上会表现出空泡、肿胀、内嵴排列紊乱或消失等异常[41]。实验研究表明，心理应激下卵母细胞线粒体分布不均，mtDNA拷贝数降低，细胞内ATP含量降低，造成卵母细胞线粒体功能受损，影响卵母细胞的生长发育[42]。因此，调畅情志、改善不良的情绪状态也是DOR防治过程的重要环节。

综上所述，DOR过程中存在线粒体异常，主要包括线粒体数量、结构和分布、线粒体自噬及线粒体膜电位等的改变，造成卵母细胞及颗粒细胞衰老或发育不良，最终导致DOR的发生和发展。了解线粒体异常在DOR中的机制，有助于制定针对线粒体损伤的精确的治疗策略，并将治疗关口前移，有效预防和减缓线粒体异常引起的DOR。