溴结构域和超末端结构域家族与哺乳动物生殖

文兰，祝静，高辉，张昌军，刁红录*

(1.湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心，十堰 442000；2.湖北医药学院生物医学工程学院，十堰 442000；3.湖北省生殖医学临床医学研究中心，十堰 442000；4.湖北医药学院生物医药研究院，十堰 442000)

溴结构域和超末端结构域(Bromodomain and extra-terminal domain，BET)家族成员是一类含有溴结构域的蛋白。溴结构域是一种由约110个氨基酸组成的，存在于真核生物中的保守蛋白质基序，是已知唯一可以结合乙酰化赖氨酸残基的蛋白质模块，其在结构上具有4个α-螺旋和2个环，可与组蛋白和其他蛋白质中的乙酰化赖氨酸残基结合[1]。组蛋白乙酰化是组蛋白修饰的重要事件之一，BET能够特异性的识别组蛋白上乙酰化的染色质位点，通过激活转录因子来促进基因的表达，对染色质结构和功能有重要的意义[2-3]。不仅如此，BET蛋白还可以作为蛋白质支架、有丝分裂标记、细胞周期调节因子和转录调节因子调节相关基因的转录与表达，发挥重要的生物学作用[4]。本文主要对BET家族在精子发生、胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)分化、胚胎发育及妊娠分娩中的作用进行综述。

一、溴结构域和超末端结构域概述

BET家族由四名成员组成：溴结构域蛋白2(BRD2，又称RING3和Fsrg1)、溴结构域蛋白3(BRD3，又称Fsrg2和ORFX)、溴结构域蛋白4(BRD4，又称Fsrg4、MCAP和HUNK1)以及睾丸特异性含溴结构域的蛋白(BRDT，又称Fsrg3和BRD6)[5]。BETs包含两个串联的溴结构域和一个超末端结构域(ET)，其中溴结构域与染色质内的核小体相互作用，是BET蛋白调控基因转录所必需的；ET是一个由约80个氨基酸组成的保守结构域，通过招募特异性效应蛋白发挥调控功能[6]。此外，还有一个C端结构域，仅存在于BRD4和BRDT的两个家族成员结构中，是招募正性转录延长因子b(Positive transcription elongation factor b，P-TEFb)所必需的结构。BETs可与位于“超级增强子”中的组蛋白上乙酰化的赖氨酸或基因启动子区结合，对基因转录进行表观遗传调控，与细胞生长、分化和炎症密切相关。BETs属于胞核蛋白，可以影响细胞的基因转录，参与DNA修复和调节细胞周期[7]。此外，溴结构域可以特异性识别乙酰化的赖氨酸，促进染色质开放，激活或暂停RNA聚合酶Ⅱ(RNA Pol Ⅱ)复合物以促进或抑制转录延长，它的作用位点包括组蛋白H3上的乙酰化赖氨酸14(H3K14ac)、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、非组蛋白如红系核蛋白转录因子GATA-1、碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)类型的转录因子TWIST、RelA和信号传导和转录激活因子3等[8]。BET与靶标分子相互作用的形成，为修饰染色质的效应子成功募集到启动子和增强子奠定了基础，支持组蛋白和转录因子乙酰化的识别[9-10]。综上所述，BET通过其特殊的结构域识别乙酰化的赖氨酸，作用于特定的靶标，对染色质的转录调节功能进行调节。

二、BETs与哺乳动物生殖

1.BETs与精子发生：精子发生过程受睾丸生精小管调控，包括精原细胞增殖、精母细胞减数分裂和精子形成，是由精原细胞有丝分裂产生精母细胞，精母细胞通过减数分裂形成单倍体细胞群即精子细胞的过程[11]。四种BET基因都在成年哺乳动物的睾丸中表达，表达具有时空差异性。在小鼠中，BRD4在精原细胞中表达水平较高，BRD2在精原细胞中表达水平较低；但在精母细胞晚期和圆形精子细胞中BRD2表达水平最高，Brd3 mRNA在圆形精子细胞中有较高水平的表达；BRDT的第一个溴结构域(BD1)缺失会导致睾丸形态严重受损、精子形态严重缺陷、精子浓度降低；BRDT可以激活精母细胞进入第一次减数分裂时所需基因的细胞周期调节蛋白A1，当BRDT发生突变时会导致精母细胞减数分裂停止在前期，由此可见，BRDT是精子发生所必需的[1，5]。BRDT还可以作用于精母细胞减数分裂后乙酰化的染色质，并且只有在H4K5和H5K8同时乙酰化的情况下，BRDT的第一个溴结构域BD1才与组蛋白H4结合。由于H4K5和H4K8的乙酰化是高乙酰化H4的一个特征，因此，BRDT也是第一个被确定为可以鉴别高乙酰化H4的特异性因子。在减数分裂后期阶段，精母细胞的细胞核体积会急剧减少，全基因组组蛋白移除，在此过程中，组蛋白首先会被过渡蛋白取代，随后被鱼精蛋白取代，这种取代与组蛋白H4的高乙酰化有关，因为当组蛋白H4高乙酰化时，染色质直接或者通过与BRDT等溴结构域蛋白的结合去促进组蛋白的移除。在精子细胞中组蛋白乙酰化和BRDT都可促进圆形精子细胞的激活，减数分裂后，BRDT与基因转录起始点上结合的丧失，与其在单倍体细胞中的表达减少有关[12]。此外，BRDT可以结合并识别生精细胞的减数分裂相关基因的转录起始位点上的乙酰化组蛋白，从而激活减数分裂。当BRDT的溴结构域失去功能时，不能结合乙酰化的赖氨酸，就会影响染色质的转录激活，改变精母细胞的正常染色质组织，影响染色体轴的长度[13]。BRD4在小鼠精子发生的减数分裂期和减数分裂后均可表达，精子发生过程中的染色质重组与顶体形成和组蛋白过度乙酰化是同时开始的，随着组蛋白过度乙酰化，BRD4在精子细胞顶体底部的核膜上形成一个与顶体直接连在一起的环，但此环在顶体突变小鼠中不会形成。顶体突变的小鼠与人类球形精子症患者高度相似，均表现出核压实和生育缺陷，这是一种顶体畸形或缺失、精子头部呈圆形、染色质压实异常的情况，说明BRD4在整个精子发生的过程中发挥着重要的作用[14]。综上所述，BRD4和BRDT在精子发生的过程中都发挥着重要的作用，尤其是BRDT，不仅在减数分裂的过程中高乙酰化组蛋白H4，还可以与基因转录起始点上乙酰化的组蛋白结合调节转录与调控，从而对减数分裂中基因激活以及精母细胞的染色质产生重要影响。

2.BETs与ESCs：ESCs主要依赖一组核心多能性转录因子来保持自我更新能力和细胞可塑性，这些细胞具有独特的开放色质结构，在组蛋白的N端尾部有丰富的翻译后修饰，这使得它们能够维持高水平的转录活性[15]。在肿瘤中，BRD4以多种方式维持干细胞的多能性[16-17]。BRD4还可以维持ESCs的多能性以及干细胞基因的表达，敲除了Brd4基因的小鼠由于内细胞团的退化会发生胚胎致死，BRD2或BRD3沉默不影响ESCs集落形态或干细胞基因的表达，这说明BRD2和BRD3对于ESCs的维持不是必须的，而BRD4对于ESCs的维持至关重要[18-19]。BETs也在细胞周期进程和有丝分裂中发挥重要作用，BRD2、BRD3和BRD4在新合成的DNA上显著富集。沉默了BRD2、BRD3或BRD4基因，S期细胞染色质上的增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)水平表达下调，BRD2、BRD3或BRD4的ET结构域会引起PCNA保留在S期染色质上，影响DNA的复制[19-20]。P-TEFb由细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶9(CDK9)和细胞周期蛋白亚基组成，可以磷酸化RNA Pol Ⅱ的C末端结构域的色氨酸，BRD4与组蛋白修饰剂、染色质重塑剂和P-TEFb相互作用，从而暂停和开始转录延伸的过程[21-22]。此外，ESCs的分化过程中，组蛋白H3和H4的乙酰化整体性减少，这表明组蛋白乙酰化在ESCs多能性的维持中起着重要作用。有研究表明，BET蛋白抑制剂JQ1可以抑制BET的BD活性，从而导致ESCs核心转录因子Nanog表达下调，而且与BRD2和BRD3相比，BRD4与JQ1的结合力更强[18]。在Brd4基因敲除小鼠中，ESCs的形态分化增强，Nanog表达水平下调，这说明BRD4可以识别乙酰化H4K16，调节Nanog启动子的转录活动，因此，BRD4抑制剂JQ1对ESCs的作用可能主要是通过抑制其与Nanog启动子内乙酰化组蛋白的结合来介导的[23-24]。所以说，BRD4通过识别H4K16ac与ESCs的Nanog启动子相互作用，进而维持Nanog的表达，从而影响ESCs的干细胞基因的表达与多能性。

3.BETs与胚胎发育：胚胎发育是从受精卵发育成胚胎，再由胚胎发育成胎儿，直至娩出的过程。在小鼠妊娠中期(胚胎发育至13.5 d)时，BRD2在胚胎的大脑中表达最高，Brd2缺失的小鼠，其胚胎大小整体性减小，大脑发育缺陷；Brd4缺失会引起小鼠内细胞团的退化导致胚胎在着床前死亡[25-26]。所以，Brd2和Brd4基因敲除的小鼠都会出现使胚胎发育异常。BRD2是赖氨酸乙酰转移酶7(Lysine acetyltransferase，KAT7)向核糖体RNA(rRNA)位点募集所必需的载体，也可以增强组蛋白H4乙酰化。小鼠Ly-1抗体反应克隆基因(Rattus norvegicus Ly1 antibody reactive，Lyar)mRNA可在早期胚胎的未成熟精母细胞和睾丸中检测到，Lyar可与BRD2-KAT7复合物结合，加速组蛋白H4和组蛋白H3乙酰化，并且通过BRD2增强KAT7和BRD4向rDNA募集，促进rRNA的合成，使rRNA上调，rRNA合成的调节是促进包括人ESCs在内的各种类型干细胞分化的一个重要因素，由此可知，BRD2可以调节早期胚胎中ESCs的发育[27]。此外，有研究表明BRDT蛋白在整个精子核中都能被检测到，在精子核的早期分解过程中，残留的BRDT可能与这些保留的组蛋白相互作用，并参与调节早期父系基因胚层特异性转录子基因的转录，对胚胎发育产生一定的影响[1]。综上所述，BRD2可以影响小鼠胚胎器官的发育，BRD4却影响小鼠内细胞团的进化，总之这些研究表明，尽管相关BET家族成员的基本结构是保守的，但它们在哺乳动物胚胎发育中的功能是多样的，对胚胎发育具有重要意义。

4.BETs与妊娠分娩：多项研究结果表明BETs可以结合乙酰化染色质，调节细胞增殖和炎症免疫过程，并且在妊娠与分娩的过程中发挥着重要的作用[28-31]。子宫肌层激活是分娩的正常过程，它是通过肌肉收缩相关蛋白如催产素受体(Oxytocin receptor，OXTR)、间隙连接蛋白(Connexin 43，CX43)、前列腺素内过氧化物合成酶2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)和前列腺素F2α受体(Prostaglandin F2 alpha Receptor，PTGFR)的作用而发生的。前列腺素F2α(Prostaglandin F2 alpha，PGF2α)通过PTGFR发出信号，也可以通过上调这些收缩相关蛋白的表达，刺激子宫肌层细胞的促炎性细胞因子和趋化因子来参与分娩的准备[32]。BET蛋白抑制剂JQ1显著降低了OXTR、PTGS2和PTGFRmRNA的表达以及PGF2α分泌，Brd2敲低可导致OXTR的表达降低，Brd4敲低会导致PTGFR表达降低，Brd3和Brd4同时敲低可导致PGF2α表达降低，说明BET蛋白可以诱导炎性信号，使肌层细胞转变为收缩状态[31]。因此，BET蛋白可以通过对OXTR、PTGF、RPGF2α的调控在分娩过程中发挥重要的作用。NF-κB信号通路参与分娩过程中促炎性的调节[33]，BET蛋白则通过结合并激活NF-κB族中RELA蛋白来促进炎症[34-35]。因此，BET蛋白可以通过支持NF-κB调控转录对炎性反应及分娩相关介质发挥作用，从而利于调节哺乳动物的妊娠分娩。

三、展望

在组蛋白修饰中，赖氨酸乙酰化修饰已被广泛研究，组蛋白乙酰化可以影响染色质结构和DNA的功能，从而调节转录、DNA复制和修复，以及细胞周期的进展。在哺乳动物生殖的领域中，BETs蛋白对于精子发生、胚胎发育以及妊娠分娩都有着重要的影响，这对染色质的结构和胚胎发育过程中表观遗传控制的主要标记基因的表达及相关机制具有十分重要的研究意义，同时也为胚胎着床、胚胎发育以及不孕不育的发生机制提供新的科学理论参考和治疗策略。