头颈部鳞状细胞癌miR-423 基因拷贝数变异和多态性分析

郑银海，喻 莹，黎桂珍，吴隆吉，刘玉婷，蒲兴祥，李彬彬*

（广东医科大学 1.第二临床医学院；2.基础医学院，广东东莞 523808；3.湖南省肿瘤医院胸部内二科，湖南长沙 410031）

头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）占头颈恶性肿瘤的90%以上，近年来其发病率和死亡率明显上升，已成为全球第八大恶性肿瘤[1]。鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一种起源于鼻咽部上皮细胞的头颈部恶性肿瘤，其病理类型主要为鳞状细胞癌。NPC 发生具有明显的种族、家族聚集性和地区差异，主要高发于我国南方及东南亚地区，其独特的流行病学分布特点提示着遗传因素在NPC 发生中起重要作用[2]。基因组改变是肿瘤的重要特征，这些改变包括点突变，插入/缺失，拷贝数变异（copy number variation，CNV）以及结构变异等。基因组改变随肿瘤的发展而积累，进而导致抑癌基因失活和癌基因激活，成为其主要致病因素之一[3]。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是反映个体遗传差异的重要分子标志，与多种肿瘤遗传易感性有关。miR-423 是近年来发现的肿瘤相关miRNA，其表达异常或SNP 参与多种肿瘤的发生、发展和预后[4]，但其在HNSC 中的作用尚不很清楚。本研究通过生物信息学分析HNSC 组织中miR-423 的表达和CNV 表现，并进一步探讨其rs6505162 位点SNP 与NPC 易感性的关系。

1 资料和方法

1.1 数据集筛选和分析

1.1.1 miR-423 在HNSC 中的表达分析 利用TCGA可视化平台UALCAN 数据库，在TCGA 数据集中检索“HNSC”“hsa-miR-423”，分析miR-423 在HNSC 和正常对照组织中的表达，并分析其表达水平与患者组织学分级、TNM 分期和淋巴结转移的关系。

1.1.2 miR-423 在HNSC 中的CNV 分析 利用TCGA可视化平台cBioPortal 数据库获得Head and Neck Squamous Cell Carcinoma（TCGA，PanCancer Atlas）数据集，其中496 例HNSC 样本具有完整的突变和CNV 资料。CNV 数据来源于Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 阵列平台，使用GISTC2.0分析miR-423 的CNV 情况。下载对应样品的临床信息，分析CNV 分布与患者年龄、性别、HPV 感染、组织学分级、TNM 分期和生存状态的关系。

1.2 一般资料

选取2014 年1 月-2015 年12 月在湖南省肿瘤医院确诊的NPC 患者156 例（病例组）及健康体检者195例（对照组）。病例组中男110 例，女46 例；平均年龄（47.78±11.28）岁。对照组中男128 例，女67 例；平均年龄（46.98±10.60）岁。两组受试者的年龄及性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。所有病例均经临床病理组织活检确诊为鳞状细胞癌，尚未接受放、化疗治疗，并排除合并其它原发和继发肿瘤。对照组为体检健康者，临床和实验室各项检查指标正常，本人及家族无恶性肿瘤病史。研究方案通过医院医学伦理委员会审批，受试者均知情后签署同意书。

1.3 miR-423 rs6505162 多态性分析

1.3.1 基因组DNA 提取 采集所有受试者的静脉血各3 mL，采用北京天根生物技术有限公司的血液基因组DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，并测定其浓度和纯度，-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析针对 miR-423 rs6505162 位点设计合成PCR 扩增特异性引物，正向引物：5´-CCCCTCAGTCTTGCTTCGTA-3´，反向引物：5´-ACTTGAGCTTCTGCCAAGGA-3´。PCR反应体系为：2× GoTaq Master Mix 7.5 µL，正向和反向引物各1 µL，模板DNA 1 µL，加ddH2O 至15 µL。采用限制性内切酶Csp6 I（美国Thermo 公司）对PCR 产物进行酶切。酶切产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，紫外线凝胶成像系统拍照，并进行基因分型。随机抽取5%样本送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。

1.4 统计学处理

所有数据采用SPSS 18.0 和GraphPad Prism 7.0 软件进行分析。计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。采用拟和优度χ2检验分析各基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律。采用非条件logistic 回归模型分析各基因型和等位基因与鼻咽癌发病风险的关联。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-423 基因在HNSC 中的表达

利用UALCAN 数据库对TCGA 中526 例样本进行分析，其中HNSC 组织482 例，正常对照组织44 例，结果如图1A 所示，HNSC 中miR-423 mRNA 的表达水平明显高于正常对照组织（P＜0.01）。分析miR-423 表达水平与患者临床病理特征的关系，发现其在HNSC 中的表达与肿瘤组织学分级、TNM 分期和淋巴结转移均无明显相关性（图1B～D）。

图1 基于TCGA 数据的miR-423 在HNSC 中表达及与患者临床病理特征的相关性

2.2 miR-423 基因在HNSC 中的CNV 分布

利用cBioPortal 对TCGA 中496 例HNSC 样本进行分析发现，miR-423 基因在HNSC 组织中未发现有氨基酸错义突变，但在125 例样本中发生了CNV，变异率为25.20%，其中缺失（Shallow Deletion）45 例（9.07%）、正常（Diploid）371 例（74.8%）、扩增（Gain）80 例（16.13%）（见图2）。分析HNSC 组织中CNV 分布与患者临床病理特征的关系，发现CNV 分布与患者年龄和HPV 感染有关（P＜0.05），而与性别、组织学分级、TNM 分期、肿瘤大小、淋巴结转移和生存状况无关（P＞0.05）（见表1）。

表1 HNSC 中 miR-423 CNV 分布与患者临床病理特征的关系

图2 基于TCGA 数据的HNSC 组织中 miR-423 基因CNV分布

2.3 miR-423 rs6505162 基因型分析

采用PCR-RFLP 和测序鉴定miR-423 rs6505162位点的基因型（见图3A、B）。miR-423 rs6505162 位点扩增目的片段大小为127 bp，经酶切后有3 种基因型，AA 基因型仅有127 bp 1 条带，CC 基因型出现108、19 bp 2 条带，CA 基因型出现127、108 和19 bp 3 条带。

图3 miR-423 rs6505162 的基因型

2.4 miR-423 基因型和等位基因与NPC 发病风险的相关性

基因型和等位基因频率分布见表2。miR-423 rs6505162 在对照组和病例组中的基因型频数分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P＞0.05），提示具有良好的群体代表性。rs6505162 各基因型在病例组和对照组中分布差异无统计学意义（P＞0.05）。采用非条件logistic 分析各基因型与鼻咽癌发病风险的关系，对年龄和性别校正后，在纯合子模型（AAvsCC）、杂合子模型（CAvsCC）、显性遗传模型（AA+CAvsCC）和隐性遗传模型（AAvsCC+CA）中均未发现各基因型与鼻咽癌易感性具有明显的统计学关联（P＞0.05）。但在等位基因模型（AvsC）中，与C 等位基因相比，携带A 等位基因可增加NPC 发病风险（OR=1.419，95% CI 1.009～1.997，P=0.044）。

表2 miR-423 rs6505162 基因型和等位基因频率在病例组和对照组中的分布

3 讨论

CNV 属于染色体结构变异，常由基因组重排导致，相比SNPs，其覆盖了更大范围的基因序列，可以捕获更多的遗传信息[5]。目前认为，CNV 不仅是个体遗传差异的基础，也在体细胞恶性转化、肿瘤发生、进展及转移中发挥着重要作用。CNV 可能通过改变基因剂量、干扰编码序列或干扰基因调控来影响基因表达、表型变异和表型适应[3，5]。肿瘤驱动基因CNV 已成为肿瘤细胞基因组变异检测的重要生物标志物。

miR-423 被发现是一个肿瘤相关miRNA，但其具体的功能依赖于不同的肿瘤类型。miR-423 在乳腺癌组织中呈明显高表达，可通过靶向锌指蛋白ZFP36 促进肿瘤细胞增殖和迁移，并与其化疗抵抗相关[6]。miR-423 通过靶向调控转移抑制基因BRMS1促进肝癌细胞的增殖和侵袭[7]。但也有研究显示miR-423-5p 在结直肠癌组织中的表达明显降低，并与肿瘤分期呈负相关，通过激活caspase 通路诱导细胞的凋亡[8]。基于TCGA 数据库，我们发现，与正常对照组织相比，miR-423 在HNSC 组织中的表达明显增高，提示其可能发挥癌基因的作用。进一步分析miR-423 在HNSC 中的基因变异情况，未发现有氨基酸错义突变，但在125 例（25.20%）样本中发现有CNV，其中80 例（16.13%）存在扩增；此外，CNV 分布与病人年龄以及HPV 感染有关，提示miR-423 中CNV 可能影响其表达，参与HNSC 的发生、发展。

近年来，miRNA SNPs 为肿瘤遗传易感性研究提供了新的思路。位于pri-miRNA、pre-miRNA 或成熟miRNA 基因序列中的SNPs 可能导致成熟miRNA水平变化、新miRNA 产生和miRNA 与靶序列结合效应改变，影响miRNA 对靶基因的调控，进而对肿瘤发病风险和进展产生影响。位于pre-miRNA 的miR-423 rs6505162 位点的SNP 被发现与多种肿瘤的发生、发展和预后相关，但在结果上存在较大的分歧。Yin 等[9]研究发现miR-423 rs6505162 CA/AA 基因型可降低中国非吸烟女性人群肺癌的发病风险，A 等位基因可能是一个保护性因素。但另一项研究则显示该多态性与增高的乳腺癌发病风险相关[10]，CA/AA 基因型被发现与较差的肿瘤预后相关[11]。本研究对湖南汉族人群中miR-423 rs6505162 SNP 与NPC 发病风险进行了分析，发现rs6505162 各基因型与鼻咽癌发病风险无明显相关性，但在等位基因模型中，与C 等位基因相比，A 等位基因可增加NPC 易感性。本次对照组中的miR-423 rs6505162 最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）为0.226，与已报道中国南方人群MAF（0.229）接近，但明显高于中国北京汉族人群（0.150）（https://asia.ensembl.org/）。这种分布的地区差异是否与鼻咽癌发病风险有关，尚有待进一步证实。

综上所述，miR-423 CNV 可能参与了HNSC 的发生，并且 rs6505162 A 等位基因可能对鼻咽癌易感性产生一定的影响，将为鼻咽癌遗传学机制研究提供实验依据。但由于本研究纳入的样本量较少，结果存在一定的局限性，尚需进一步扩大样本量进行验证。