人工采摘和管理对普洱生茶化学成分的影响分析

瞿岩俨，杨子嘉，李 军，李 溱,*

（1.中国农业大学生物学院，北京 100193；2.中国农业大学网络技术中心，北京 100083）

普洱茶产自云南西南部，以云南特有的大叶种茶青鲜叶经过萎凋、杀青、揉捻、晒干制成晒青毛茶，即普洱生茶[1]。普洱生茶经过渥堆发酵后得到普洱熟茶[2]。云南大叶种茶树是乔木，与常见的灌木型小叶种茶树在外形上有显著差异[3]。云南现存大量树龄超过一百年、甚至五百年的大叶种古茶树。由于历史和自然条件等原因。一些古树茶园在生产过程中被荒废，在一定时期内处于无人管理的荒废状态。荒废茶园在恢复采摘和人工管理后，初期采摘茶叶的品质往往不佳，有较强的苦涩味并缺乏香气。在经过3～5 a的采摘和人工管理后，茶叶苦涩味逐步褪去，香气逐步提升，品质逐步恢复。本研究于2018年在云南省临沧市双江县勐库镇祭天山一个已经被荒废超过60 a的古树茶园采集了处于自然野生状态的茶青，制作成普洱生茶，又分别于2020年和2021年再次在该茶园收集经过采摘和人工管理2～3 a后的茶青，制成普洱生茶。经过对比品饮发现，2018年初次采摘的普洱生茶味道苦涩，没有普洱茶特征性的清香和花果香，气味如同腐烂的木头。而2020年采摘的茶叶带有普洱茶特有的清香，且入口苦涩味也有所减弱。2021年采摘的普洱茶，则香气清纯持久、滋味浓厚回甘。

本研究使用基于高分辨质谱的代谢组学技术，对野生普洱茶和经过人工采摘和管理的普洱茶的内含物质进行分析，解析普洱茶口味和品质变化与其内含物质之间的关联关系。对普洱茶的无机离子、氨基酸、可溶性糖、黄酮、多酚、抗氧化能力进行分析，结合细胞实验研究野生普洱茶和经过人工管理的普洱茶细胞毒性和抗氧化能力差异，旨在为解析野生大叶种茶树在人工管理下的演化机制提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普洱古树生茶样品由云南国色端庄茶叶有限公司提供，分别于2018、2020、2021年3月底至4月初采摘于云南省临沧市双江县勐库镇祭天山。茶叶嫩度为一芽两叶和一芽三叶，并在当年按照GB/T 22111—2008《地理标志产品 普洱茶》以相同的加工工艺制作成普洱生茶饼，茶饼在室温条件下在昆明仓库密闭贮藏。2018年是该茶园荒废超过60 a后的首次人工采摘。

氨基酸、咖啡因标准品 美国Sigma公司；AccQ·Tag氨基酸衍生剂 美国Waters公司；超纯水、乙腈（均为色谱级） 美国Thermo Fisher Scientific公司；乙酸铵、甲酸（均为色谱级） 北京迪科马科技有限公司；用于检测细胞增殖及毒性的试剂盒（Biorigin/BN15201）、2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（Biorigin/BN16033） 北京百瑞极生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

I-Class超高效液相色谱仪 美国Waters公司；Q-Exactive Focus高分辨质谱仪、ICS-5000离子色谱仪美国赛默飞世尔科技公司；R-5418离心机、Thermomixer振荡仪 德国Eppendorf公司；KC-10S超声仪 中国宁波硕力公司；BSA2202S天平 德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

茶叶样品使用研钵研磨成粉末，准确称取0.02 g茶叶粉末放入离心管中，加入1 mL去离子水，室温超声提取30 min，14 000 r/min离心10 min，取上清过0.1 μm滤膜，进行后续的无机离子、可溶性糖、氨基酸含量分析和代谢组学分析等。

1.3.2 无机离子、可溶性糖含量分析

将茶叶提取液稀释后进行离子色谱分析，每种样品3 个重复。阳离子使用20 mmol/L的甲磺酸流动相，Dionex CS12A阳离子交换柱（4 mm×250 mm）和电导检测器进行检测[4]。可溶性糖使用Dionex PA10色谱柱（4 mm×250 mm），流动相为纯水和200 mmol/L NaOH溶液的梯度洗脱程序，使用电化学检测器进行检测[5]。

1.3.3 游离氨基酸含量检测

取10 μL茶叶提取液，加入50 μL硼酸盐缓冲液和20 μL氨基酸衍生剂，室温放置1 min，55 ℃振荡器加热振荡10 min，冷却至室温后进行质谱分析，每种样品3 个重复。使用Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相A为20 mmol/L乙酸铵（pH 5.0），流动相B为乙腈溶液（乙腈-水，80∶20，V/V），洗脱程序：0 min，97% A，3% B；2 min，97%～88% A，3%～12% B；9.5 min，88%～66% A，12%～34% B；10～12 min，66%～0% A，34%～100% B；12.5～15.5 min，0%～97% A，100%～3% B。流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；样品室温度15 ℃；进样量1 μL。使用Q-Exactive Focus高分辨质谱仪检测色谱洗脱物的一级和二级质谱，正离子模式；毛细管温度320 ℃；喷雾电压3.5 kV；辅助气温度350 ℃；雾化气，辅助气和反吹气流速分别为35、10、5 个单位；质量扫描范围m/z70～1 000[6]。

1.3.4 代谢组学分析

1.3.4.1 样品处理及分析条件

将茶叶提取液稀释后进行基于高分辨质谱的代谢组学分析，每种样品6 个重复，将茶叶提取物等量混合得到质控样品。使用Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相A为水（含有0.1%甲酸），流动相B为乙腈（含有0.1%甲酸）；洗脱程序：0 min，95% A，5% B；5 min，95%～70% A，5%～30% B；10 min，70%～5% A，30%～95% B；13 min，5% A，95% B；13.1 min，5%～95% A，95%～5% B；16 min，95% A，5% B。流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；样品室温度8 ℃；进样量5 μL[6]。质谱条件同氨基酸分析。

1.3.4.2 茶叶内含物质含量测定

向200 μL茶叶提取物中加入2.5 mL 0.1 mol/L福林-酚试剂，混匀后静置5 min，加入2 mL 7.5% Na2CO3溶液和5 mL水，室温避光放置1 h，检测反应后溶液在波长765 nm处的吸光度，以没食子酸作为标准品测定茶叶中总酚含量。

向50 μL茶叶提取液中加入3 mL铁离子还原/抗氧化能力试剂和6 mL水，37 ℃放置20 min，检测反应后溶液在波长590 nm处的吸光度，以抗坏血酸作为标准品测定茶叶的抗氧化能力[7]。

1.3.5 细胞实验

对照组培养基：未加茶叶提取物的DMEM培养基。实验组培养基：每1 mL DMEM培养基加入20 μL茶叶提取物的培养基，每种茶叶做5 个重复。U2OS细胞系由中国农业大学生物学院傅静雁教授课题组提供。

CCK-8细胞增殖实验：取4 000 个U2OS细胞悬液铺板（96 孔板），贴壁后使用实验组和对照组培养基在37 ℃，5%二氧化碳的细胞培养箱中培养8 h，弃掉培养基，用新鲜培养基清洗后，加入100 μL培养基和10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育3 h。用酶标仪检测波长450 nm处吸光度[8-9]。

DCFH-DA测定ROS：用无血清培养基将DCFH-DA探针稀释1 000 倍作为工作液（8 μL母液+8 mL培养基）。取密度为1.5×105/mL的细胞悬液铺板（35 mm培养皿），贴壁后利用实验组和对照组培养基培养8 h（培养条件同上）。之后弃掉培养基，用无血清培养基清洗两次，加入1 mL DCFH-DA探针工作液。37 ℃孵育30 min，进行荧光检测。激发波长500 nm，发射波长525 nm[10]。

1.4 数据统计及图表绘制

无机离子、可溶性糖含量分析的离子色谱数据使用Chromeleon7.2 SR5软件进行峰面积积分和定量分析。在游离氨基酸含量检测中，质谱数据使用Xcalibur软件进行峰提取，根据标准品的峰面积计算样品中游离氨基酸的含量。在代谢组学分析中，质谱采集的原始数据导入Progenesis QI软件（美国Waters公司）进行色谱保留时间对齐、质谱峰匹配与峰面积提取，单因素方差分析（ANOVA），并筛选具有组间显著性差异的化合物。QI软件提取的质谱特征峰列表导入SIMCA-P 13.0软件（瑞典Umetrics公司）中，进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析。筛选得到的差异化合物使用二级质谱结合HMDB和茶叶代谢物数据库进行鉴定。柱状图绘制利用GraphPad Prism（GraphPad Software）和Origin软件（OriginLab），热图分析使用Origin软件。显著性分析利用SPSS软件（美国SPSS股份有限公司）进行单因素方差分析（ANOVA）中的Duncan分析。

2 结果与分析

2.1 无机离子含量

图1 不同采摘年份普洱生茶中K+含量Fig. 1 Contents of K+ in raw Pu-erh tea picked in different years

K+可以维持适当的跨膜电位，调节细胞膨压，还作为酶的辅基参与代谢调节[11]。植物在缺K+时，抗旱、抗寒能力下降，叶片失水，老叶边缘焦枯[12]。2020年和2021年茶叶中K+含量存在显著差异（图1），但不同年份采摘的茶叶中K+含量均为10 mg/g左右，2020年与2021年茶叶的K+含量仅相差8.7%，说明人工管理对茶叶中K+含量的影响较小，茶树生长环境较稳定。

2.2 可溶性糖含量

图2 不同采摘年份普洱生茶中葡萄糖、蔗糖含量Fig. 2 Contents of glucose and sucrose in raw Pu-erh tea picked in different years

普洱茶中检测到主要的可溶性糖为葡萄糖和蔗糖，其中蔗糖含量略高于葡萄糖（图2）。2018年和2020年茶叶的葡萄糖含量具有显著差异，但变化倍数较小，仅为1.093 倍，而2020年采摘茶叶的蔗糖含量明显高于其他2 个年份，说明人工管理过程会显著影响茶叶的可溶性糖含量。蔗糖可以降低多酚类物质的涩味强度及持续时间，这可能是2020年茶滋味改善的原因之一[13]。

2.3 代谢组学分析

2.3.1 PCA结果

图3 不同采摘年份的普洱生茶差异代谢物PCA得分图Fig. 3 Principal component analysis score plot of differential metabolites in raw Pu-erh tea picked in different years

表1 不同采摘年份的普洱生茶差异化合物信息Table 1 Information about the differential compounds in raw Pu-erh tea picked in different years

续表1

对3 个年份采摘的普洱茶进行高分辨质谱分析，共检测到5 322 个特征质谱峰，其中满足P≤0.05，变异系数≤20%，变化倍数≥1.5的特征峰有1 104 个，对这1 104 个质谱峰进行PCA，质控样品很好地聚集在PCA得分图的中间，不同年份采摘的茶可以明显分开，且随采摘年份呈现规律性的分布，显示人工干预对普洱茶内含物质的组成与含量产生显著影响（图3）。

2.3.2 差异代谢物鉴定

从5 322 个特征质谱峰中筛选了P≤0.05，变异系数≤20%，变化倍数≥1.5，变量投影重要性大于0.94，质谱峰面积大于7 400的400 个峰进行二级质谱鉴定，共鉴定到69 个差异代谢物。其中包括黄酮及其衍生物类物质18 个，儿茶素类/多酚类物质16 个，生物碱类物质11 个，其他代谢物5 个（表1）。对鉴定到差异代谢物进行热图分析（图4），发现大部分儿茶素类物质在2021年茶叶中含量较高；部分儿茶素类、部分黄酮及其衍生物类在2020年茶叶中含量较高，而大多数黄酮及其衍生物类物质在2018年茶叶中含量较高，说明采摘和人工管理对茶叶中儿茶素及黄酮及其衍生物等内含物质的组成与含量产生了较大影响。

总的来看，2021年茶中儿茶素类化合物含量较高，是2021年茶汤入口回甘的主要原因。而2018年茶中黄酮及其衍生物含量较高，是2018年茶汤苦涩的原因之一。2020年茶叶则体现了2018年向2021年的转化过程，茶叶中儿茶素类物质逐渐增加，黄酮及其衍生物逐渐减少。表明采摘和人工管理可以显著改变茶叶的化学组成，进而改善其口感与品质。

图4 不同采摘年份普洱生茶差异代谢物热图Fig. 4 Heatmap of differential metabolites in raw Pu-erh tea picked in different years

2.3.3 儿茶素/多酚类化合物

儿茶素类化合物是茶叶中最主要的多酚，约占茶叶中茶多酚含量的60%～80%[14]，具有卓越的清除ROS、抑制肿瘤细胞增殖能力[15-16]。儿茶素类化合物呈味苦涩回甘，是茶叶中重要的呈味物质[17]。Robichaud等[18]的研究认为儿茶素类化合物的苦味强于涩味。采摘于2018年茶叶中(-)-表没食子儿茶素3-对-香豆酸酯和鞣花酸含量较高。而2020年采摘的茶叶中7-没食子酰儿茶素、1,4-二-O-咖啡酰奎尼酸、(+)-没食子儿茶素、表没食子酰儿茶素、聚酯型儿茶素C等含量较高。2021年采摘的茶叶中没食子酸及没食子酸酯、3’-没食子酰原翠雀素B2、异茶黄素、3-O-没食子酰金缕梅单宁、茶黄酸、异茶黄素3’-没食子酸酯等含量较高（图4）。化学分析显示3 个年份茶叶中总多酚含量没有显著差异（图5），说明采摘和人工管理会对茶叶中总多酚含量影响较小，但会显著改变茶叶中儿茶素类化合物组成和相对含量。

图5 不同采摘年份普洱生茶多酚含量分析Fig. 5 Contents of polyphenols in raw Pu-erh tea picked in different years

2.3.4 黄酮类化合物

黄酮类化合物是茶叶中重要的呈味和活性物质，其呈味苦涩，可以增强咖啡因的苦味[19]，同时具有清除氧由基等抗氧化作用[20]。黄酮类化合物可以通过肠道微生物群发挥其抗氧化、降血脂、调血糖、抑炎症等生理功效，预防二型糖尿病、阿兹海默症等多种疾病[21]。在本实验鉴定到属于黄酮及其衍生物类物质的差异代谢物中，花旗松素3-阿拉伯糖苷、芹菜苷、花青素7-葡萄糖苷等黄酮类化合物在2021年茶叶中含量最高，而飞燕草素3-(3’-p-香豆酰葡糖苷)、槲皮素3-(3-p-香豆酰葡糖苷)等在2020年采摘的茶叶中含量较高，而其余的大部分黄酮及其衍生物类化合物均在2018年含量较高（图4）。

2.3.5 生物碱类化合物

图6 不同采摘年份普洱生茶中咖啡因含量Fig. 6 Contents of caffeine in raw Pu-erh tea picked in different years

咖啡因、可可碱、次黄嘌呤均为次黄嘌呤类生物碱，它们是茶叶苦味的主要来源[22]。通常认为咖啡因可以与儿茶素类化合物相互作用，增强儿茶素类化合物的回甘与苦味，但是对儿茶素类化合物的涩味影响不大[17]。可可碱则可作为支气管舒张剂和血管舒张剂[23]。对咖啡因的质谱信号进行分析发现，不同年份采摘的茶叶中咖啡因含量相差不大（图6）。可可碱在2021年采摘茶叶中含量最高，在2020年与2018年采摘茶叶中含量相差不大，而次黄嘌呤在2018年茶中含量最高（图4）。咖啡因约占茶叶干质量的1%～5%，不同年份采摘茶叶中咖啡因含量保持稳定说明人工干预没有对茶树生长产生显著影响。除了次黄嘌呤类生物碱，游离核苷酸也是重要的呈味物质。在2021年茶中含量较高的脱氧肌苷单磷酸是一种5’-单磷酸核苷酸（图4），被认为会加强鲜味的味觉[24]。

2.3.6 氨基酸含量分析

图7 不同采摘年份普洱生茶总氨基酸及茶氨酸含量Fig. 7 Contents of total amino acids and theanine in raw Pu-erh tea picked in different years

氨基酸是茶叶中重要的呈味物质。对比3 个年份采摘茶叶的总氨基酸含量（图7），采摘于2018年茶中总氨基酸含量最低，为49.53 μmol/g（8.03 mg/g）；2021年最高，为63.31 μmol/g（10.00 mg/g）；2020年为57.85 μmol/g（9.20 mg/g）。

茶叶中含量最高的氨基酸是茶氨酸，是茶叶鲜爽味的主要来源[25]，茶氨酸还可以减缓心理和生理应激反应，舒缓情绪[26]。2021年采摘的茶叶中茶氨酸含量达到25.10 mol/g，对应茶叶的鲜爽味也最强（图7），说明采摘和人工管理会显著改善茶叶中茶氨酸的含量，提高茶叶品质。连续人工管理和采摘4 a（2021年）茶叶中的丙氨酸（2.44 μmol/g）和谷氨酰胺（3.49 μmol/g）含量也都显著高于长期未采摘的茶叶（2018年，0.99 μmol/g和1.23 μmol/g），丙氨酸和谷氨酰胺都呈鲜味，表明人工管理可以显著提高茶叶的鲜爽度[27]（图8）。

图8 不同采摘年份普洱生茶氨基酸含量变化热图Fig. 8 Heatmap of amino acid contents in raw Pu-erh tea picked in different years

采摘于2021年茶中的赖氨酸含量明显低于其他年份。2018、2020和2021年茶中赖氨酸含量分别为1.18、0.64 μmol/g和0.68 μmol/g，赖氨酸呈苦味[28-29]，其含量随采摘时间增加而下降说明人工管理可以有效改善茶叶的苦涩（图8）。

茶叶中精氨酸的含量在人工管理后迅速上升，2018年茶叶中精氨酸含量为0.70 μmol/g，到了2020年，精氨酸含量迅速提高到3.99 μmol/g，到2021年仍维持3.27 μmol/g的高含量。精氨酸呈苦味回甘[30]，被认为具有增香作用[31]，其含量在人工采摘后迅速上升，表明人工管理可以显著提高茶叶的香气，同时可以加强茶叶的回甘（图8）。

对不同年份采摘茶叶的氨基酸含量进行聚类分析（图8），结果分成3 类，第1类在长期未采摘的茶叶（2018年）中含量最高，主要是呈苦味的氨基酸，如苯丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和组氨酸等[32]；第2类在2020年茶叶中含量最高，包括呈鲜味的天冬氨酸和有增香作用的精氨酸；第3类在2021年茶叶中含量最高，主要是呈鲜味的氨基酸，如茶氨酸、谷氨酸，以及呈甜味的氨基酸，如苏氨酸和丙氨酸[6]。另外，具有镇静、抗压等生理活性的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）也是在2021年茶中含量最高[33]。

从氨基酸定量分析和聚类分析结果看，长期未采摘茶叶的氨基酸总含量低，且呈苦味的氨基酸含量高。开始每年的正常采摘之后，茶叶中氨基酸总含量增加，呈苦味的氨基酸含量降低，呈甜味和鲜味的氨基酸含量增加，且GABA含量也随之增加，茶叶的品质随采摘时间的延长逐渐提高。

2.3.7 细胞增殖实验和ROS测定实验

图9 细胞增殖实验和ROS测定实验Fig. 9 Inhibitory effect of raw Pu-erh tea picked in different years on tumor cell proliferation and ROS scavenging effect

研究表明绿茶提取液可以抑制骨肉瘤癌细胞的迁移[34]，本实验使用U2OS细胞（骨肉瘤细胞）表征茶汤的细胞毒性和抗氧化能力。CCK-8细胞增殖实验表明，茶汤可以显著抑制U2OS细胞的增殖。其中2021年采摘茶叶的茶汤对U2OS细胞增殖的抑制最明显，2018年次之，2020年茶叶的茶汤对U2OS细胞增殖的抑制最弱（图9）。

图10 不同采摘年份的普洱生茶抗氧化能力分析Fig. 10 Antioxidant capacity of raw Pu-erh tea picked in different years

茶叶中的多酚与黄酮均有抗氧化的作用。化学分析结果显示，不同年份采摘茶叶在细胞外的抗氧化能力没有显著差异（图10）。但DCFH-DA细胞ROS自由基分析显示采摘于2021年茶叶对U2OS细胞内ROS的清除能力最强，2018年茶汤次之，2020年茶汤对U2OS细胞内ROS清除能力最弱（图9）。

细胞增殖实验和ROS测定实验结果显示，采摘于2021年茶叶对U2OS细胞增殖的抑制作用最强，对ROS的清除能力也最强。即2021年采摘的茶叶在抗癌、抗氧化方面的功效更好。

3 结 论

本实验使用离子色谱、高效液相色谱-高分辨率质谱联用、化学分析和细胞活性实验等方法，解析了经过多年荒废后的云南大叶种茶树在恢复采摘和人工管理后内含物质的变化规律，及其与普洱茶品质、口味和保健功效的关联关系。研究结果表明茶叶无机离子、咖啡因、总多酚含量较为稳定，说明茶树生长较为稳定。化学分析结果显示3 个年份采摘茶叶的抗氧化能力无显著差异，但细胞增殖实验和ROS测定实验结果显示2021年采摘茶叶对U2OS细胞内ROS的清除作用最强，对U2OS肿瘤细胞增殖的抑制作用也最强。氨基酸定量分析结果显示，经过多年荒废后的茶叶中氨基酸总含量低，且呈苦味的氨基酸含量高，而经过多年人工采摘后（2021年），茶叶氨基酸总含量以及呈鲜味和甜味的氨基酸含量均显著高于其他两个年份的茶叶。

代谢组学分析发现可以用于区分不同采摘年份茶叶的69 个化合物。其中呈味苦涩的黄酮及其衍生物类化合物和生物碱中的次黄嘌呤等在2018年茶叶中含量较高；呈味苦涩但能增强回甘和增强鲜味的物质，如儿茶素类物质、生物碱中的脱氧肌苷单磷酸等在2021年茶中含量较高；而2020年茶介于2018和2021年之间，呈味苦涩但能增强回甘和增强鲜味的物质较2021年茶中较少，而呈味苦涩的物质较2018年的较少。

综上，经过4 a人工管理后，2021年采摘的普洱生茶的品质、口味和保健功效均有大幅提升。本研究为解析从荒废到人工管理转变过程中普洱茶内含物质的变化规律提供了理论和物质基础。