miR-383-5p转染对人卵巢颗粒细胞株KGN凋亡的影响及其机制

李韵颖，曹琴英，韩映雪，赵健，户月，苗穗兵，甄亚丽，伊凤蕊

1 河北医科大学附属石家庄市人民医院妇产科，石家庄 050000；2 石家庄市第四医院妇产科

多囊卵巢综合征（PCOS）是一类以排卵功能障碍、高雄激素血症或超声显示多囊卵巢为特征的多因素、多系统性疾病，影响全球8%～13%的育龄妇女［1］。PCOS女性中不孕的发生率为72%［2］，尽管通过干预生活方式、降雄激素治疗、促排卵药物、IVF-ET技术的应用，其妊娠率较前有了很大的提高，但仍达不到预期水平，而且发现其卵母细胞受精能力和胚胎着床率低、流产率高等问题，这与卵泡发育异常、卵母细胞质量降低、子宫内膜功能障碍等有关。卵巢颗粒细胞作为卵泡微环境中主要的体细胞，紧邻卵母细胞，其异常的增殖、凋亡和氧化应激等直接影响卵母细胞质量及胚胎发育［3］。微小RNAs（miRNAs）是一类由18～23个核苷酸组成内源性非编码单链RNA，通过调控并降低下游靶基因的表达，参与机体细胞几乎全部的生物学过程中。微小RNA-383-5p（miR-383-5p）在多种恶性肿瘤中低表达，如鼻咽癌、乳腺癌、肺癌等，影响癌细胞的增殖能力及对放化疗的敏感性，扮演“抑癌基因”的角色。研究［4］发现，miR-383-5p在PCOS患者卵巢颗粒细胞中差异表达。2021年10月—2022年5月，我们观察了miR-383-5p转染对人卵巢颗粒细胞株KGN凋亡的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂KGN细胞（上海中乔新舟生物）。TriQuick总RNA提取试剂（北京索莱宝），miR-383-5p及U6引物和miRNAs RT-qPCR试剂盒（广州锐博生物），DMEM/F-12培养基（Gibco公司），胎牛血清（浙江四季青），胰蛋白酶-EDTA消化液和胰蛋白酶消化液（北京索莱宝），miR-383-5p mimics（上海吉玛），Lipofectamine 2000（美国Invitrogen），活性氧（ROS）检测试剂盒（上海碧云天），丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成），N-乙酰半胱氨酸（NAC）（上海碧云天），细胞凋亡检测试剂盒（上海翊圣），RIPA裂解液（强），Bax鼠单克隆抗体和β-actin鼠单克隆抗体（武汉赛维尔），Bcl-2兔多克隆抗体和cleaved caspase 3鼠单克隆抗体（武汉三鹰），羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗（Seracare），ECL化学发光超敏显色试剂盒（上海翊圣）。

1.2 KGN细胞培养 将KGN细胞从液氮中取出，放置在37℃恒温水浴箱内快速复苏，依据细胞密度种至合适的培养皿中，隔日更换1次培养基。

1.3 KGN细胞分组、miR-383-5p mimics转染及转染效率判定 采用qRT-PCR法。取对数生长期细胞，经胰蛋白酶-EDTA消化液消化，按每孔3.5×105细胞接种于6孔板中，放置于37℃、5%CO2培养箱过夜。当细胞融合度在80%～90%时分组，并严格按照Lipofectamine 2000说明书进行转染150 pmol的miR-383-5p mimics。收集细胞加入TriQuick总RNA提取试剂提取细胞内总RNA，Nanodrop One超微量分光光度计测定RNA浓度及纯度。严格按照miRNAs RT-qPCR试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA后进行扩增。扩增程序如下：95℃预变性10 min；95℃变性2 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s（重复40个循环）；溶解曲线生成。U6作为miR-383-5p的内参。采用2-ΔΔCT的方法进行计算。CT值为每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环 数。Blank组、miR-383-5p mimics组、miR-383-5p mimics+NAC组miR-383-5p相对表达量分别为1、98.849±11.208、99.104±10.022，miR-383-5p mimics组和miR-383-5p mimics+NAC组miR-383-5p表达较Blank组升高（P均＜0.05）。这一结果表明，细胞转染成功。

1.4 各组细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的检测 ①细胞凋亡率测算：采用流式细胞术。使用不含EDTA的胰蛋白酶消化液常规消化收集细胞，加入1 mL预冷的1×PBS重悬洗涤两次，4℃环境下 以1 000 r/min速度离心5 min，弃上清。加入1×Binding Buffer调整细胞密度为1×106细胞/mL。将100 μL细胞悬液转移至5 mL流式管内，依次加入5 μL的Annexin V-PE和10 μL的7-AAD，避光，室温反应15 min。加入400 μL的1×Binding Buffer，轻弹流式管底混匀。于1 h内使用流式细胞仪进行检测。使用FlowJo_V10软件分析各组细胞的凋亡率。②细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase 3检测：采用Western blot法。将细胞内加入RIPA裂解液（强）冰上裂解30 min，后收集至离心管内检测蛋白浓度。95℃煮10 min使蛋白变性，室温冷却后备用。使用10%分离胶进行电泳，电泳结束后湿转60 min。将PVDF膜放入5%脱脂奶粉中室温封闭1 h后孵育一抗［Bax抗体（1∶1 000）；Bcl-2抗体（1∶3 000）；cleaved caspase 3抗体（1∶1 000）；β-actin抗体（1∶1 000））］，4℃过夜。室温孵育二抗（1∶5 000）1 h后ECL化学发光超敏显色试剂盒显色，拍照后对各组条带的灰度值进行统计及分析。

1.5 各组细胞内氧化应激相关指标检测 ①细胞ROS检测：采用流式细胞术。将收集的细胞用1 mL的DMEM/F-12培养基重悬洗涤两遍，以1 000 r/min速度离心5 min，弃上清。加入1 mL的DCFH-DA稀释液（1∶1 000），置于37℃培养箱中孵育30 min，每5 min颠倒混匀1次，以保证细胞和探针充分接触。取出离心管，以1 000 r/min速度离心5 min，弃上清。加入培养基重悬洗涤两遍，以充分去除未进入细胞的DCFH-DA。500 μL的1×PBS重悬细胞后转移至流式管。于1 h内使用流式细胞仪进行检测，使用FlowJo_V10软件分析各组细胞内活性氧的水平。②细胞MDA检测：将收集的细胞加入适量1×PBS重悬（1×106细胞加入0.3～0.5 mL的1×PBS）。使用超声破碎仪提取细胞内蛋白，Nanodrop One超微量分光光度计检测蛋白浓度。按照MDA测定试剂盒的说明书，将蛋白样本和试剂依次加至离心管中，盖好盖子，涡旋仪混匀，放置恒温水浴箱中95℃孵育80 min。取出离心管，流水冷却后，4 000 g/min速度离心10 min。取上清200 μL加至96孔板。使用酶标仪在532 nm波长处测定吸光度值。按照以下公式计算各组细胞内MDA水平，MDA含量（nmol/mg）=（测定管-对照管）/（标准管-空白管）×标准品浓度÷蛋白浓度（mg/mL）。③细胞SOD活性检测：制备细胞蛋白样本及检测蛋白浓度同“1.5”。按照SOD活性测定试剂盒的说明书，将蛋白样本和试剂依次加至96孔板中。将96孔板放置酶标板上振荡混匀后，37℃孵育20 min，在450 nm波长处测定吸光度值。按照以下公式计算各组细胞内SOD活性，SOD抑制率（%）=×100%，SOD活性（U/mg）=SOD抑制率÷50%×反应体系稀释倍数÷蛋白浓度（mg/mL）。

1.6 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染miR-383-5p后各组凋亡率及凋亡相关蛋白表达比较 相较于空白对照组，miR-383-5p mimics组细胞内凋亡率明显升高，并且抑凋蛋白Bcl-2的表达水平降低，促凋蛋白Bax和cleaved caspase 3的表达水平升高（P均＜0.05）。这说明miR-383-5p具有促进KGN细胞凋亡的作用。再进一步检测发现，NAC干预组细胞的凋亡率低于miR-383-5p mimics组（P＜0.05），同时Bax和cleaved caspase 3蛋白的表达水平下调，Bcl-2蛋白的表达水平上调（P＜0.05），即抗氧化剂NAC逆转了miR-383-5p促进KGN细胞凋亡的作用。这一结果表明，miR-383-5p通过诱导细胞内的氧化应激从而引发了细胞的凋亡。见表1。

表1 转染miR-383-5p后各组细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达比较（）

表1 转染miR-383-5p后各组细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达比较（）

注：与Blank组比较，*P＜0.05；与miR-383-5p mimics组比较，△P＜0.05。

组别miR-383-5p mimics+NAC组miR-383-5p mimics组Blank组凋亡率（%）5.347±0.698△8.013±1.252*1.650±0.886 Bax蛋白0.657±0.171△0.870±0.227*0.535±0.163 Bcl-2蛋白1.498±0.586△0.962±0.476*1.541±0.686 cleaved caspase 3蛋白1.504±1.009△2.136±1.259*1.239±1.321

2.2 转染miR-383-5p后各组ROS、MDA、SOD活性比较 相较于空白对照组，miR-383-5p mimics组细胞内ROS和MDA的水平升高，抗氧化物SOD水平下降（P＜0.05）。说明miR-383-5p诱导了KGN细胞内氧化应激的发生。然而，当我们将100 μmol/L的抗氧化剂NAC添加至miR-383-5p mimics组作用24 h后，NAC干预组细胞内ROS和MDA的水平低于miR-383-5p mimics组，SOD水 平则较高，说明NAC抑制了细胞内氧化应激的发生（P＜0.05）。见表2。

表2 转染miR-383-5p后各组细胞氧化应激相关指标比较（）

表2 转染miR-383-5p后各组细胞氧化应激相关指标比较（）

注：与Blank组比较，*P＜0.05；与miR-383-5p mimics组比较，△P＜0.05。

组别miR-383-5p mimics+NAC组miR-383-5p mimics组Blank组ROS（%）27.133±13.931△56.167±19.610*23.583±19.440 MDA（nmol/mg）0.610±0.155△0.755±0.121*0.586±0.073 SOD（U/mg）48.016±4.223△38.259±4.774*47.351±3.608

3 讨论

大量研究表明，PCOS患者卵母细胞不成熟、质量差及胚胎发育能力低归因于其卵巢颗粒细胞异常的增殖、凋亡、氧化应激等。而卵巢颗粒细胞的功能和生物学行为受激素、炎症因子等影响。随着生物学信息和测序技术的发展，miRNAs作为一种新型调控分子，参与卵巢颗粒细胞的生物学过程。miR-383-5p是一种位于染色体8p22的内含子miRNA，其宿主基因为SGCZ。该基因编码ζ-肌聚糖，后者属于跨膜蛋白家族。研究报道，miR-383-5p在PCOS患者卵巢颗粒细胞中差异表达，但其对细胞内氧化应激及凋亡的影响和其内在机制尚不明确。

众所周知，机体内存在一套完善的抗氧化体系，可以将ROS等自由基维持在一个相对低水平，有利于细胞的正常功能。但当自由基的产生与抗氧化体系的清除能力失衡时，就会引发氧化应激。氧化应激是人类多种疾病的主要病理生理机制［5］。过多的ROS导致DNA、蛋白质等细胞成分损伤，触发线粒体膜上通透孔的开放，诱导细胞凋亡。PCOS女性卵巢组织中上调的miR-21通过抑制程序性细胞死亡因子4/ROS轴促进胰岛素处理的小鼠颗粒细胞增殖［6］。ROS诱导的氧化应激可能是卵母细胞质量差的原因［7］。先前报道称，miR-383-5p可以通过靶向抑制过氧化物酶3—一种维持内源性氧化还原稳态的抗氧化蛋白［8］，诱导糖尿病性视网膜病变组织中ROS产生、凋亡、自噬等［9］。鉴于人卵巢颗粒瘤来源的KGN细胞株具有类似人卵巢颗粒细胞的功能。本研究中我们将miR-383-5p转染至KGN细胞，发现过表达miR-383-5p可导致ROS和MDA升高，SOD降低。提示miR-383-5p可激活人卵巢颗粒细胞内氧化应激状态。

细胞凋亡是一种在生理或者病理状态下发生的程序性细胞死亡，其中Bcl-2家族蛋白起着关键作用。Bcl-2家族包括以Bcl-2为代表的抑制凋亡的蛋白和以Bax为代表的促进凋亡的蛋白。经证实，miR-16等多种miRNAs均可通过调控PCOS患者卵巢颗粒细胞凋亡影响其功能。miR-383-5p在胃癌组织中的表达相较于邻近非肿瘤组织中偏低，与Bcl-2的表达水平负相关，并且两者都与肿瘤的恶性程度和转移相关，体外实验发现miR-383-5p可以靶向调控Bcl-2的表达升高细胞凋亡率［10］。本研究通过检测发现，将KGN细胞过表达miR-383-5p后，细胞的凋亡率升高，并且凋亡相关蛋白也随之改变。提示miR-383-5p可以促进人卵巢颗粒细胞株KGN的凋亡。

如前所述，氧化应激可导致细胞内稳态失衡，从而诱导细胞凋亡。为进一步探究miR-383-5p诱导的KGN细胞氧化应激和凋亡之间的关系。我们将抗氧化剂NAC添加至过表达miR-383-5p的KGN细胞内，可见细胞的凋亡率和促凋蛋白Bax、cleaved caspase 3表达水平降低，抑凋蛋白Bcl-2表达水平升高。本研究结果提示，miR-383-5p促进人卵巢颗粒细胞凋亡的功能可能是通过激活氧化应激途径诱导的。

总之，miR-383-5p可以通过激活人卵巢颗粒细胞株KGN中氧化应激途径诱导细胞凋亡。这为PCOS的病理生理机制提供了理论依据，为PCOS的诊断和治疗提供了新思路。