不同病情及病程CAP新生儿外周血维生素D、淋巴细胞亚群、中性粒细胞吞噬功能比较及相关性分析

沈怀云，王磊，夏群，刁艳霞，周梦竹

蚌埠医学院第一附属医院儿科，安徽蚌埠 233004

新生儿社区获得性肺炎（CAP）是一种常见的新生儿出生后感染性肺炎，病原体主要包括细菌、病毒及其他病原体，如金黄色葡萄球菌、呼吸道合胞病毒等，一些革兰氏阴性杆菌或与病毒混合感染后所致足月新生儿CAP 病死率大大增加［1-3］。一些病原体如细菌在肺部的感染会激活患儿免疫系统，产生了一系列免疫应答，从而使宿主细胞表面抗原结构发生改变，最终导致患儿免疫系统功能紊乱，病情进展迅速者甚至死亡［4-6］。维生素D（VD）是一种脂溶性维生素，具有维持体内钙稳定和调节机体免疫功能等作用，尤其与小儿呼吸道感染密切相关。CAP 目前已经成为了新生儿阶段最为严重的感染性疾病之一，且其临床症状和体征缺乏特异性，监测不同病情和病程CAP 新生儿免疫功能及其影响因素如VD 含量，是保护此类新生儿个体安全的关键点。2019 年11 月—2021 年11 月，我们比较了不同病情及病程CAP 新生儿外周血VD、淋巴细胞亚群、中性粒细胞（NE）吞噬功能，并分析VD 含量和免疫功能的相关性，旨在为新生儿CAP 病情轻重、病程进展及疗效评估提供参考价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取蚌埠医学院第一附属医院收治 的 CAP 新 生 儿 62 例 ，男 32 例 ，女 30 例 ；胎 龄（39.23 ± 1.02）周，日龄中位数17.5（14～25）d；体质量（3.58 ± 0.51）kg。新生儿CAP 包括院外感染院外发病和院外感染入院后在潜伏期内发病患儿。所有新生儿CAP 病例均符合《诸福棠实用儿科学》（第8 版）以及儿童CAP 管理指南诊断标准［7］：①咳嗽，气促，痰鸣，伴或不伴发热、黄疸等症状；②表现为紫绀、口吐泡沫或者伴有呻吟、呼吸困难或吸气性三凹征；③双肺闻及呼吸音粗或者干湿啰音；④X 线胸片显示为斑点状条絮影或斑片状、片状阴影，伴或不伴肺气肿。根据病情分为轻症者40例（轻症组）、重症者22例（重症组）（新生儿重症CAP符合上述儿童CAP 管理指南重症肺炎诊断标准［7］：①在吸入气中氧浓度分数≥60%的情况下，不能维持动脉血氧饱和度≥92%；②出现休克；③呼吸频率增快，脉速伴严重呼吸窘迫和多器官功能衰竭，伴或者不伴动脉血氧分压升高；④反复出现呼吸暂停或慢而不规则的呼吸）。根据病程分为急性期（入院后24 h 内，急性组）、恢复期（治疗7 d病情好转时，恢复组）。另选择同期健康体检新生儿30 例（对照组），男18 例，女12 例；胎龄（39.15 ± 1.38）周，日龄中位数 16（12.75～24.25）d；体质量（3.51± 0.54）kg。两组一般资料比较无统计学差异，具有可比性。排除标准：①出生时有严重的先天性发育畸形和遗传代谢性疾病；②吸入性肺炎等非感染性肺炎；③入组前使用过相关影响检测指标的药物。本研究已报医院的伦理委员会审核，并获得批准，所有新生儿家长都在告知书上签名表示同意。

1.2 外周血VD、淋巴细胞亚群、NE 吞噬功能指标检测 取空腹状态下采集各组新生儿静脉血各3 mL。①VD：采用WATERS 公司的高效液相色谱仪检测25 羟维生素D［25（OH）D］含量。抽取静脉血1 mL，离心取0.5 mL 血清以甲醇沉淀蛋白，以正己烷提取后，离心取上清液过膜。甲醇∶水（95∶5）为流动相，选用 Venusil MP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱进行色谱分离，流速为1 mL/min，紫外检测波长265 nm，柱温30 ℃。②淋巴细胞亚群：使用真空采血管（EDTA-K2 抗凝）抽取静脉血1 mL，将标本管编号为A 与B，A 管内加入CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 试剂20 μL，B 管 内 加 入 CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC试剂20 μL，向A管与B管内各加入100 μL全血，轻轻摇匀，避光置室温孵育共15 min，向两管内各加入FACSLysing 溶血液2 mL，避光置室温孵育共10 min，300 g离心5 min，弃去上清液，以PBS洗涤细胞 2 次，300 g 离心 5 min，同样弃去上清液，再向A、B 管内各加入1%的聚甲醛0.5 mL，采用美国BD公司的FACSCalibur 流式细胞仪进行检测，用Multi-SET 程序分析淋巴细胞各亚群的相对计数，最后读取结果。③NE吞噬率及吞噬指数：将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213置于水浴中加热至100 ℃，总共10 min，以杀灭细菌，再以无菌生理盐水稀释成6×108/mL备用；吸取60 μL肝素钠抗凝血液滴入凹玻片的凹孔内，加上述制备好的葡萄球菌菌液20 μL，进行充分混匀；并置入铺有湿纱布的有盖容器中，于37 ℃温箱中作用30 min，期间每10 min摇匀一次；作用完毕后，吸取1小滴混合液置于洁净的载玻片一端，推成薄片、晾干，采用快速瑞—姬氏染色剂染色10 min，清水冲洗和晾干后在油镜下随机寻找100个NE，计算 NE 吞噬率及噬指数（吞噬率=100 个NE 中吞噬细菌的细胞数/100×100%，吞噬指数=100个NE中吞噬细菌的总数/100）［8］。

1.3 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，比较采用t检验或单因素方差分析，其中两两比较用独立样本t检验，多组比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t法；采用Spearman 秩相关作两变量相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 轻症组及重症组和对照组外周血VD 含量、淋巴细胞亚群、NE 吞噬功能指标比较 结果见表1。

表1 轻症组及重症组和对照组外周血VD含量、淋巴细胞亚群、NE吞噬功能指标比较（）

表1 轻症组及重症组和对照组外周血VD含量、淋巴细胞亚群、NE吞噬功能指标比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与轻症组比较，＃P＜0.05。

组别轻症组重症组对照组NE吞噬指数3.01±0.97*2.26±0.93*＃3.61±0.29 n 40 22 30 25（OH）D（ng/mL）15.98±2.91*13.96 ± 3.04*＃18.08±4.00 CD3+（%）80.54±7.42*73.70±6.76*＃84.47±5.09 CD4+（%）58.53±6.86*52.66 ± 5.64*＃63.17±4.03 CD8+（%）20.12±0.70 19.59±1.46 19.82±1.39 CD19+（%）12.21±3.69*15.86±4.86*＃9.51±3.42 CD56+（%）10.50±3.27*8.44 ± 2.90*＃12.84±2.32 NE吞噬率（%）55.41±14.27*43.10 ± 13.37*＃62.10± 7.04

2.2 急性组及恢复组和对照组外周血VD 含量、淋巴细胞亚群、NE吞噬功能指标比较 结果见表2。

表2 急性组及恢复组和对照组外周血VD含量、淋巴细胞亚群、NE吞噬功能指标比较（）

表2 急性组及恢复组和对照组外周血VD含量、淋巴细胞亚群、NE吞噬功能指标比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与恢复组比较，＃P＜0.05。

组别急性组恢复组对照组NE吞噬指数2.75±1.01*＃3.09±0.78*3.61±0.29 n 62 62 30 25（OH）D（ng/mL）15.26 ± 3.09*＃16.57±3.33*18.08±4.00 CD3+（%）78.15 ± 7.83*＃81.29±6.03*84.47±5.09 CD4+（%）56.45 ± 7.00*＃59.42±5.57*63.17±4.03 CD8+（%）19.93±1.06 19.99±0.95 19.82±1.39 CD19+（%）13.50±4.47*＃11.69±3.37*9.51±3.42 CD56+（%）9.77 ± 3.27*＃11.10±2.47*12.84±2.32 NE吞噬率（%）51.04 ± 15.06*＃55.76±11.50*62.10± 7.04

2.3 急性期组VD含量与淋巴细胞亚群、NE吞噬率及吞噬指数相关性分析 急性组VD 含量与CD3+、CD4+、CD56+细胞及NE 吞噬率、吞噬指数呈正相关（r分别为 0.354、0.321、0.386、0.520、0.559，P均＜0.05），与 CD19+细胞呈负相关（r为-0.342，P＜0.05），与CD8+细胞无相关性（r为0.130，P＞0.05）。

3 讨论

新生儿CAP 是由各种病原体感染引起的弥漫性肺部病变，如不及时治疗常会造成患儿呼吸困难，甚至呼吸衰竭，严重者可导致患儿死亡或因缺氧留下神经系统后遗症。由于CAP 的流行病学正在发生变化，且导致CAP 的病原体在不同的国家和地区之间存在差异，大多数细菌性新生儿CAP 是经验性治疗，选择适当的抗生素治疗越来越困难，同时新生儿免疫功能极不成熟，因此新生儿CAP 的治疗对儿科医师来说具有很大的挑战性。

VD 是促进机体骨骼生长和调节其免疫功能的重要微量营养素。VD 信号转导通过激素形式的1，25-二羟维生素D与核VD受体结合发挥对机体先天性免疫和适应性免疫的调控，还可通过调节T 细胞中的 mTOR 途径实现免疫稳态［9］。因此，VD 信号转导应该能提高机体对抗细菌或病毒等病原体感染的免疫力。VD 缺乏会明显增加人体感染病原体的几率，且感染后病情易进展和加重。临床研究已证明，血清25（OH）D 缺乏的老年新冠肺炎患者肺受累更严重、病程更长和死亡风险更高，即使在并发症较少的年轻新冠肺炎患者中，也检测到VD 水平较低［10］。刘梁等［11］报道，感染性肺炎患儿的血清 25（OH）D 水平较低，且病情较重者的水平更低。近期还有研究认为，低浓度的血清VD 与新生儿肺炎有显著的相关性，且VD 水平可以预测新生儿肺炎的机械通气需求和住院时间［12］。25（OH）D 缺乏的新生儿患感染性肺炎的风险增加，且重症肺炎新生儿外周血单个核细胞VD 受体表达下调［13］。本研究结果中轻症组及重症组VD 含量显著低于对照组，重症观察组VD 含量低于轻症者，说明血清VD 含量与新生儿CAP 病情轻重有关，VD 水平越低，患儿病情可能越重；急性组及恢复组VD 含量均低于对照组，提示低VD 含量与新生儿CAP 发生关系密切，且在急性期降低后短期内无法完全恢复正常。CAP新生儿血清VD 水平降低可能与肺部感染后患儿对VD的吸收减少、同时机体处于高代谢状态，对VD 的需求和排出增加等一些因素有关。

机体的免疫细胞由固有免疫细胞与适应性免疫细胞组成。固有免疫细胞主要包括NK 细胞、NE、树突状细胞等等，固有免疫细胞参与天然免疫反应，发挥非特异性免疫功能，如NK细胞、NE不需要抗原的刺激，也能自发地杀伤靶细胞；适应性免疫细胞包括T 淋巴细胞和B 淋巴细胞，它们除具有天然免疫细胞的免疫功能外，还可对一些病原体感染作出针对性反应，从而产生后天获得性免疫反应，发挥特异性免疫功能。各个淋巴细胞亚群应维持一定的数量和比例，并且相互作用才能维持机体正常的免疫功能。新生儿免疫系统功能薄弱，在罹患呼吸道感染性疾病后，免疫系统更易受到损害，淋巴细胞亚群往往会发生变化。MCGRATH-MORROW 等［14］将新生和幼年小鼠分别吸入大肠杆菌致下呼吸道感染后，发现新生小鼠肺部固有免疫细胞招募延迟，肺部细菌清除也明显延迟，并且死亡率更高。另外文献［15］报道，新生小鼠肺炎时对肺部CD4+T 细胞转录反应减弱。有研究［16-17］认为，细菌性肺炎的新生儿CD3+、CD4+和CD8+T 淋巴细胞均降低，而CD19+B 淋巴细胞升高，病情越重，住院时间越长，NK细胞及其亚群的比例越低。吴秀霞等［18］发现，感染性肺炎新生儿CD3+、CD4+T淋巴细胞和NK 细胞比例较对照组显著降低，CD8+T 细胞、CD19+B 细胞比例较对照组显著升高，但CD19+B细胞产生免疫球蛋白的功能是低于对照组的。目前，针对感染性肺炎患儿NE 功能变化的研究较少。袁浩等［8］发现，肺炎支原体肺炎患儿外周血NE 吞噬率及吞噬指数较健康对照组下降，表明患儿肺部感染后，机体非特异性免疫NE 吞噬功能下降。本研究显示，轻症组及重症组CD3+、CD4+、CD56+细胞水平及NE 吞噬率、吞噬指数显著低于对照组，CD19+细胞水平高于对照组；重症组CD3+、CD4+、CD56+细胞水平及 NE 吞噬率、吞噬指数低于轻症组，CD19+细胞水平高于轻症组；提示淋巴细胞亚群、NE吞噬率及吞噬指数与新生儿CAP的病情轻重有关，患儿病情越重，特异性和非特异性免疫功能紊乱越严重。本研究还显示，急性组和恢复组CD3+、CD4+、CD56+细胞水平及 NE 吞噬率和吞噬指数均低于对照组，CD19+细胞水平高于对照组；急性组 CD3+、CD4+、CD56+细胞水平及 NE 吞噬率和吞噬指数低于恢复组，CD19+细胞水平高于恢复组；提示淋巴细胞亚群、NE吞噬率及吞噬指数与新生儿CAP的病程进展有一定关联。随着CAP 患儿病情好转，CD3+、CD4+、CD56+细胞水平及 NE 吞噬率和吞噬指数升高，CD19+细胞水平下降，但在恢复期这些特异性和非特异性免疫指标并不能达到正常新生儿水平。

VD 水平对呼吸道感染患儿特异性免疫功能如细胞免疫的影响已有不少报道。贺媛媛等［19］发现，反复呼吸道感染患儿血清VD 水平与全血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+呈正相关，而与全血 CD8+水平呈负相关。还有学者报道，CAP 新生儿25（OH）D 缺乏组CD3+、CD4+细胞阳性率及CD4+/CD8+均低于25（OH）D 正常组，细胞免疫与25（OH）D 水平相关，25（OH）D 缺乏患儿细胞免疫功能相对低下［20］。因此，VD 水平与呼吸道感染小儿的细胞免疫功能具有相关性。但VD 水平与呼吸道感染患儿非特异性免疫如NE吞噬功能的关系尚无相关报道。本文结果显示，CAP 新生儿急性期 VD 含量与 CD3+、CD4+、CD56+细胞及NE 吞噬率和吞噬指数存在正相关，而与CD19+细胞存在负相关，提示CAP 新生儿急性期VD 含量与淋巴细胞亚群、NE 吞噬功能之间存在一定的关联，VD含量减少会导致患儿特异性和非特异性免疫功能受损，它们共同参与和反映了新生儿CAP 的病情进展。

总之，CAP 新生儿外周血VD 含量减少，特异性和非特异性免疫功能紊乱，且与病情轻重和疾病进程密切关联，新生儿CAP 急性期VD 含量与淋巴细胞亚群、NE 吞噬功能之间具有一定的相关性。因此，在新生儿CAP 的治疗过程中，通过调节VD 水平，从而改善免疫功能，是否有助于患儿病情的恢复，值得我们进一步研究。