干扰FTO蛋白对人卵巢癌细胞系SKOV3增殖、迁移、侵袭的影响及其机制

黄锦源，杨静，代荫梅

首都医科大学附属北京妇产医院北京妇幼保健院妇科，北京 100026

卵巢癌是妇科常见三大恶性肿瘤之一，在妇科恶性肿瘤中病死率最高，患者预后差［1］。卵巢癌患者早期临床症状不明显或无特异性，超过75%的病例在晚期才被确诊［2］。尽管大多数患者受益于手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等，但卵巢癌的难以早期诊断、复发和耐药等问题导致整体患者预后不佳。文献［2］报道，卵巢癌的治疗取决于癌细胞本身的内在特征。因此，迫切需要研究卵巢癌进展相关基因改变和潜在分子机制。脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）是N6-甲基腺嘌呤（m6A）去甲基化酶，位于染色体 16q12.2 上［3］。FTO 在恶性肿瘤中具有差异性表达，影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、肿瘤干细胞特性和耐药等恶性生物学行为［4］。FTO 在卵巢癌中表达水平及其发生发展过程中的作用相关研究较少，且不同研究间存在较大差异，可能发挥促癌或抑癌作用。本实验选取对数生长期人卵巢癌腺癌细胞系SKOV3，并分别转染第一条靶向FTO 的小干扰RNA（siFTO-1）、第二条靶向FTO的小干扰RNA（siFTO-2），并以无靶向作用的小干扰RNA（si-NC）作对照，观察干扰FTO 对SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭的影响，并探讨其可能机制，以期验证FTO 发挥促癌或抑癌作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系、主要试剂及仪器 SKOV3 细胞购自美国ATCC细胞库。高糖DMEM培养基、Opti-MEM Ⅰ减血清培养基和胎牛血清均购自美国Gbico 公司，TRIzol Reagent 购 自 美 国 Ambion 公 司 ，ColorMixed Protein Marker、逆转录试剂盒和 2×SYBR Green qPCR Mix 试剂盒均购自武汉 ABclonal 公司，FTO 引物和GAPDH 内参引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，Lipofectamine 2000 购自美国 invitrogen 公司，si-NC、siFTO-1、siFTO-2 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，AKT 抗体、p-AKT 抗体、PI3K 抗体、p-PI3K 抗体和GAPDH 内参抗体均购自美国CST公司，FTO 抗体购自英国 Abcam 公司，ECL 试剂盒购自美国Thermo Scientific 公司，CCK-8 试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Transwell 小室购自美国Corning 公司。Nano-300微型分光光度计购自杭州奥盛仪器有限公司，荧光定量PCR 仪购自美国BIO-RAD 公司，CO2恒温培养箱和多功能酶标仪购自美国Thermo Scientific 公司，倒置相差显微镜购自日本Olympus IX51，Tanon 5200 系列全自动化学发光/荧光图像分析系统为上海天能科技有限公司。

1.2 SKOV3细胞培养及siFTO-1、siFTO-2转染和分组 SKOV3细胞系培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素的高糖DMEM 培养基，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2的细胞培养箱培养。根据细胞生长状况和培养液颜色变化进行细胞换液或胰酶消化传代培养。取对数生长期SKOV3 细胞，进行胰酶消化，后用培养基重悬，按2×105细胞/孔接种于六孔板培养，待细胞生长融合度达到70%时，分别取si-NC、siFTO-1、siFTO-2（各40 pmol）与Opti-MEM I 减血清培养基（125 μL）、Lipofectamine 2000（4 μL）充分混匀，37 ℃孵育20 min；分别将si-NC、siFTO-1、siFTO-2 转染混匀液加入已接种 SKOV3 细胞的六孔板中，转染4 h 后将培养液更换为高糖DMEM 新鲜培养基；转染后细胞分别标记为si-NC组、siFTO-1 组、siFTO-2 组（其中 siFTO-1 组、siFTO-2组主要起到平行重复实验和避免siRNA序列误差的作用）。采用qRT-PCR 法和Western blotting 法分别检测各组FTO mRNA、蛋白相对表达量以判定转染效率。qRT-PCR 结果显示，si-NC组、siFTO-1组、siFTO-2组FTO mRNA 相对表达量分别为1.00±0.00、0.25 ± 0.11、0.17 ± 0.05，siFTO-1 组、siFTO-2 组分别与 si-NC 组比较，P均＜0.05；Western blotting 法检测结果显示，si-NC 组、siFTO-1 组、siFTO-2 组 FTO 蛋白相对表达量分别为 1.02 ± 0.06、0.74 ± 0.13、0.64 ± 0.11，siFTO-1 组、siFTO-2 组分别与 si-NC 组比较，P均＜0.05；提示各组转染成功。

1.3 SKOV3 细胞增殖率测算 采用CCK-8 法。转染 24 h 后，胰酶消化收集“1.2”中 3 组 SKOV3 细胞，用高糖DMEM 培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，按100 μL/孔接种于96 孔板，每组均设置5个复孔，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2的细胞培养箱中培养；继续培养24 h 后加入CCK-8 检测试剂，10 μL/孔，在培养箱中孵育1 h，用酶标仪测定各孔450 nm 吸光度值（OD 值），并计算细胞增殖率，细胞增殖率（%）=（实验组OD 值-空白组OD 值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。

1.4 SKOV3 细胞迁移率测算 采用细胞划痕实验。待“1.2”中3 组SKOV3 细胞生长融合度达到70%后，用无菌200 μL 移液枪头垂直轻划六孔板，PBS 洗涤2～3 次，每孔加入含2%胎牛血清的高糖DMEM 培养基，分别于划痕0、72 h 显微镜下观察细胞迁移情况，并拍照。采用Image J 软件测量各组细胞划痕间隙的距离，计算各组细胞的相对迁移率，细胞相对迁移率=1-72 h 划痕间隙距离/0 h 划痕间隙距离×100%。

1.5 SKOV3 细胞穿膜细胞数观察 采用Transwell实验。将低浓度基质胶（Matrigel）均匀铺在Transwell 小室底部膜的上室面（50 μL/小室），放置培养箱中30 min 干燥后待用。转染后24 h，胰蛋白酶消化收集“1.2”中3 组 SKOV3 细胞，用无血清的高糖DMEM 培养基重悬细胞，调整细胞浓度为4×105/mL，将200 μL 无血清重悬细胞液加小室的上部，小室的下腔加入1 000 μL 含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2的细胞培养箱中孵育48 h，后以PBS 洗涤2 次，加入甲醇固定细胞30 min，用棉签轻擦拭掉上室面细胞，下室面细胞使用5%结晶紫溶液进行染色2 h，PBS洗涤3次，在显微镜200倍视野下随机拍摄5个视野计数穿膜细胞数，计算平均值。

1.6 SKOV3 细胞AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K 蛋白相对表达量测算 采用Western blotting法。转染48 h后，胰酶消化收集“1.2”中3组SKOV3细胞，加入 500 μL 的 NP-40 裂解液提取总蛋白，吹打后冰上静置30 min，4 ℃环境下，以12 000 r/min的速度离心5 min，取上清；按BCA 蛋白定量试剂盒说明书操作进行蛋白浓度的检测和蛋白定量，往定量后的上清液中加入loading buffer（上清液体积∶loading buffer 体积=4∶1），混匀后100 ℃加热10 min使蛋白变性；配制10%SDS-PAGE 凝胶，各取20 μg总蛋白进行电泳，电泳条件：120 V 过浓缩胶至蛋白marker 分离清晰后，改160 V 直到溴酚蓝跑至胶底；随后进行转膜至PVDF 膜，转膜条件为250 mA、120 min；根据蛋白marker 和待检测蛋白分子量进行剪膜，5%脱脂牛奶封闭30 min，PBST 涮洗1 次后孵育对应一抗稀释液4 ℃过夜（兔抗FTO 单克隆抗体1∶5 000，兔抗AKT 单克隆抗体1∶1 000，兔抗p-AKT单克隆抗体1∶1 000，兔抗PI3K 单克隆抗体1∶1 000，兔抗 p-PI3K 单克隆抗体 1∶1 000 和兔抗GAPDH 单克隆抗体 1∶5 000）；第 2 天 PBST 快洗 3次，慢洗3 次，每次15 min，常温下孵育辣根过氧化物酶标记二抗（1∶5 000）1 h，PBST 快洗3 次，慢洗3次，每次15 min，采用ECL试剂盒显色，经曝光、显影和定影后拍照；采用Image J 软件分析各条带的灰度值，计算各目的蛋白相对表达量并进行归一化处理。各目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/对应GAPDH灰度值。

1.7 统计学方法 采用Graph Pad Prism 9.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用独立t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖率、相对迁移率、穿膜细胞数比较 细胞增殖率、相对迁移率、穿膜细胞数比较见表1。

表1 各组细胞增殖率、相对迁移率、穿膜细胞数比较（）

表1 各组细胞增殖率、相对迁移率、穿膜细胞数比较（）

注：与si-NC组比较，P＜0.05。

组别siFTO-1组siFTO-2组si-NC组细胞穿膜细胞数（个）110.80±27.40*134.60±25.15*31.20± 6.76细胞增殖率125.20%±8.24%*121.20%±5.42%*100.00%±0.00%细胞相对迁移率47.29%±11.05%*51.08%± 8.48%*29.15%± 1.92%

2.2 各组细胞 AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K 蛋白相对表达量比较 细胞AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K 蛋 白 相 对 表 达 量 比 较见表2。

表2 各组细胞AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K蛋白相对表达量比较（）

表2 各组细胞AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K蛋白相对表达量比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别siFTO-2组siFTO-1组si-NC组p-PI3K/PI3K 0.21±0.02*0.06±0.01*0.05±0.00 AKT 0.84±0.17 0.82±0.18 0.96±0.20 p-AKT/AKT 0.38±0.01*0.26±0.02*0.18±0.01 PI3K 1.04±0.08 1.08±0.08 1.00±0.08

3 讨论

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，也是世界上重要的公共卫生问题，严重影响患者的身心健康。根据全球癌症统计数据显示，2020 年全球卵巢癌新发约 31.4 万例，卵巢癌死亡人数约 20.7 万例［5］。根据2022 年最新发布的癌症登记和随访监测数据显示，2016 年卵巢癌新发病例约5.72 万，卵巢癌死亡病例约2.72万［6］。由于卵巢癌发病隐匿不易早期发现，患者被确诊时往往处于晚期，患者常失去手术机会，而放化疗治疗效果不佳，近期和远期预后不良［2］。人卵巢癌腺癌细胞系 SKOV3 由 TREMPE 和OLD 在1973 年从一位64 岁白人女性卵巢腺癌患者的腹腔积液分离得到，其能够很好代表卵巢癌的生物特性。靶向分子治疗具有更高的靶向选择性和较高的治疗效果，积极探讨卵巢癌致病过程的分子机制，以期为卵巢癌的治疗提供新的理论依据和有前途的靶点。FTO 作为m6A 去甲基化酶，主要与m6A甲基转移酶共同调节体内m6A 水平，从而在人类生理和病理过程中发挥重要调控作用。近年多项研究显示，FTO在恶性肿瘤发病过程主要发挥促癌作用，靶向 FTO 显示出一定的治疗效果［7-9］。但 FTO 也被报道在膀胱癌［10］、肝细胞癌［11］和卵巢癌［12］中发挥抑癌作用，但FTO 在卵巢癌中的表达和作用尚存在争议。多篇文献报道显示FTO 在卵巢癌中的表达显著下调［12-15］，但 ZHAO 等［16］发现 FTO 在人卵巢肿瘤组织中表达显著上调。此外，FTO 能通过促进卵巢癌细胞增殖、抑制细胞凋亡、激活自噬过程，从而促进卵巢癌细胞的生长，发挥促癌作用［16］。然而另一项研究显示，过表达FTO 抑制体外卵巢癌细胞的集落形成、球体形成、卵巢癌干细胞的增殖和自我更新，以及体内成瘤的生长，在卵巢癌中发挥抑癌作用［12］。而下调FTO 增强卵巢癌细胞对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的耐药性［13］。过表达FTO 能降低磷酸二酯酶4B 和磷酸二酯酶1C mRNA 中的m6A 水平和稳定性，上调环磷酸腺苷水平，增强环磷酸腺苷的信号转导过程，最终抑制体内外卵巢癌的进展［12］。而下调FTO 可显著增加卷曲蛋白10 mRNA 上的m6A 水平和稳定性，进而激活下游Wnt/β-catenin 信号通路，最终导致卵巢癌细胞对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的耐药性［13］。

肿瘤的恶性生物学行为涉及多方面，比如增殖、凋亡、迁移、侵袭、耐药和肿瘤干细胞特性。为增加本实验的可信度，本实验设计合成序列不同的特异性靶向 FTO 的siRNA（siFTO-1 和 siFTO-2）进行平行重复试验。本文结果显示，与si-NC 组比较，siFTO-1组和siFTO-2 组细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著上调，说明干扰卵巢癌SKOV3细胞中FTO 的表达后可显著促进细胞增殖、迁移和侵袭能力，这提示FTO在卵巢癌中发挥抑癌作用。本文结果与HUANG等［12］和FUKUMOTO 等［13］研究结果一致，但与 ZHAO等［16］研究结果相反。FTO在卵巢癌中相矛盾的结果为后续的临床应用和靶向药物开发带来一定的挑战。在肿瘤治疗中，基于小分子化合物靶向FTO 的策略不完全适用于卵巢癌的治疗。相反，通过调节FTO内源性上下游效应分子间接促进FTO的表达或直接上调FTO 也可能是抑制卵巢癌进展的治疗方法之一。FTO 在卵巢癌中发挥促癌或抑癌作用是FTO的本身功能多样性，肿瘤微环境影响、亦或者是FTO 受时间和空间特异性影响，未来还需进一步研究和探索。

PI3K/AKT 信号通路是细胞周期过程中经典的细胞内信号通路，其上下游多种分子参与调节信号通路的激活过程，与细胞生理功能各个方面密切相关。PI3K 蛋白家族是一大类信号脂质激酶，能够磷酸化质膜上磷脂酰肌醇的3′-OH 基团；AKT 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是 PI3K 途径的关键分子［17］。PI3K 活化磷酸化导致AKT 在细胞膜上的募集和活化，而活化的Akt 具有激活cAMP 反应元件结合蛋白、抑制p27、激活磷脂酰肌醇3-磷酸和和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白等多种生物学功能，从而在许多细胞过程中起关键作用，包括葡萄糖代谢、凋亡、细胞增殖、转录和细胞迁移［17-18］。PI3K/AKT 信号通路可被表皮生长因子、胰岛素样生长因子和钙调素等多种生物分子所激活，但也能被第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因和糖原合酶激酶3β 等其他分子所拮抗［18］。此外，PI3K/AKT 信号通路的异常激活也证实与多种恶性肿瘤的进展有关，靶向PI3K/AKT 信号通路及其上下游分子可能是抗肿瘤的有效手段［19］。本研究发现，与 si-NC 组比较，siFTO-1 组和 siFTO-2 组细胞中 PI3K、AKT 蛋白相对表达量无显著变化，但p-AKT/AKT 和P-PI3K/PI3K 蛋白相对表达量显著升高，提示干扰FTO 可显著激活SKOV3 细胞中 PI3K/AKT 信号通路，表明 FTO 对卵巢癌细胞中PI3K/AKT 信号通路具有负性调控作用，本文结果不同于ZHAO 等［16］的研究报道，即FTO能促进卵巢癌细胞中AKT 的磷酸化过程。以上结论提示，上调FTO 表达间接抑制PI3K/AKT 信号通路将会为卵巢癌的治疗提供新的治疗策略和思路。

总之，干扰FTO 可显著促进卵巢癌SKOV3 细胞的增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能是通过上调PI3K 和 AKT 的磷酸化水平，进而激活 PI3K/AKT 信号通路。