山柰根茎化学成分的研究

乔 蕊 刘俊豪 皮慧芳 李 娟 杜 光*

1.泗水县人民医院，山东 济宁 273200；2.华中科技大学同济医学院药学院天然药物化学与资源评价湖北省重点实验室，湖北 武汉 430030;3.华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，湖北 武汉 430030

山柰(kaempferiagalangaL.)又名沙姜、土麝香等，味辛甘，性温，无毒。隶属姜科(Zingiberaceae)山柰属(Kaempferia)，是一种多年生宿根草本植物，主要分布于广东、海南、广西、云南、四川、台湾、福建等省区[1]。具有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗氧化、抗虫、抗血管生成等作用，在民间常用于治疗胃脘寒痛、消化不良、急性胃肠炎、跌打损伤等病症，在《本草从新》等均有记载[2-3]。近年来，从山柰属植物中分离和鉴定出了许多苯丙素类、二萜类和多氧环已烷衍生物[4-8]。为进一步开发利用民族药用资源，本研究对山柰根茎的化学成分进行研究，从中分离鉴定了15个化合物，且6个化合物首次从该植物中分离得到。

1 材料与仪器

高效液相色谱仪LC100(上海伍丰科技有限公司)；RI-201H示差折光检测器(日本昭和电工株式会社)；MODEL 1706 UV/VIS紫外检测器(美国Waters公司)；液相色谱柱为YMC·GEL ODS-A-HG (250×10 mm, 5 μm; YMC Co, Ltd, Kyoto, Japan)；核磁共振仪德国布鲁克公司(Bruker AM-400和Bruker AM-600)；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(美国Healthcar公司)；硅胶柱层析填料(100-200目/200-300目，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司)；超高效薄层色谱硅胶板(烟台江友硅胶开发有限公司)；液相所用试剂为色谱纯甲醇和乙腈(美国Sigma-Aldrich公司)。

山柰根茎于2015年3月购自安徽亳州中药材市场，由湖北省武汉市九州通医药公司的蔡尚军主任药师鉴定为姜科山柰属植物山柰(KaempferiagalangaL.)的根茎。药材样品保存于华中科技大学同济医学院药学院1号楼天然药物化学实验室。

2 方法与结果

2.1 提取与分离 山柰根茎50 kg，粉碎，用 150 L 的95%乙醇分四次冷浸，每次48 h，浓缩至2000 mL，合并滤液，减压浓缩回收乙醇得到总浸膏，将总浸膏分散于适量水中后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位847 g,乙酸乙酯部位402 g，正丁醇部位885 g。

石油醚部位以PE-EtOAc为流动相，进行硅胶柱层析梯度洗脱，每100 mL为一个馏分进行采集，经薄层检测，合并成分相似的组分，得到20个部分(Fr.1～Fr.20)。Fr.5经Sephadex LH20，以甲醇为流动相等度洗脱，又经硅胶柱，以PE-DCM梯度洗脱，结合HPLC，得化合物3(5 mg)、6(3 mg)。

乙酸乙酯部位先以PE-EtOAc为流动相，进行硅胶柱层析梯度洗脱，后换为EtOAc-MeOH梯度洗脱，经薄层检识合并成分相似的流分，共得到23个部分(Fr.1～Fr.23)。Fr.7上ODS柱，MeOH梯度洗脱，结合HPLC，得化合物2(7 mg)、9(4 mg)、10(5 mg)、11(8 mg)；Fr.8上MCI柱，MeOH-H2O梯度洗脱，并用HPLC进一步纯化，得到化合物1(9 mg)、4(3 mg)；Fr.9析出固体，抽滤与母液分离，甲醇溶解固体后用HPLC纯化，得化合物8(10 mg)、5(6 mg)；Fr.10依次用ODS柱(MeOH-H2O梯度洗脱)和Sephadex LH20(MeOH等度洗脱)进行分离，并用HPLC进一步纯化，得化合物7(5 mg)、12(8 mg)、14(2 mg)、15(2 mg)；Fr.11上ODS柱，MeOH-H2O梯度洗脱，重结晶得化合物13(5 mg)。

2.2 结构鉴定

2.2.1 化合物1 无色针状晶体,1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：7.94 (2H, d,J=8.8 Hz, H-2, 6)、6.94 (2H, d,J=8.7 Hz, H-3, 5)、3.83 (3H, s, OCH3)，以上数据与文献[9]报道对照基本一致，故鉴定化合物1为对甲氧基苯甲酸。

2.2.2 化合物2 无色晶体,1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：7.83 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2, 6)、6.77 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3, 5)，以上数据与文献[10]报道对照基本一致，故鉴定化合物2为对羟基苯甲酸。

2.2.3 化合物3 微黄色液体，有芳香味，1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ：7.55(2H, m, H-2, 6)、7.37(3H, m, H-3, 4, 5 )、7.65(1H, d,J=16.0 Hz, H-7)、6.48(1H, d,J=16.0 Hz, H-8)、4.21(2H, q,J=7.1 Hz, H-1′)、 1.30(3H, t,J=7.1 Hz, H-2′)。以上数据与文献[11]报道对照基本一致，故鉴定化合物3为反式肉桂酸乙酯。

2.2.4 化合物4 白色晶体，1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：7.52 (2H, d,J=8.7 Hz,H-2,6)、6.93(2H, d,J=8.8 Hz, H-3, 5)、7.60(1H, d,J=16.0 Hz, H-7)、6.34(1H, d,J=16.0 Hz, H-8)、3.80(3H, s, OCH3)、4.20 (2H, q,J=7.1 Hz, H-1′)、1.29(3H, t,J=7.1 Hz, H-2′)。以上数据与文献[11]报道对照基本一致，故鉴定化合物4为反式对甲氧基肉桂酸乙酯。

2.2.5 化合物5 白色晶体，1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：7.50(2H, d,J=8.8 Hz, H-2, 6)、6.91 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-3, 5)、7.58 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7)、6.29 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8)、3.79 (3H, s, OCH3)。13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 170.7 (C-9)、162.9 (C-4)、146.0 (C-7)、130.7 (C-2, 6)、128.2 (C-1)、116.4(C-8)、115.2 (C-3, 5)、55.7 (OCH3)。以上数据与文献[12]报道对照基本一致，故鉴定化合物5为反式对甲氧基肉桂酸。

2.2.6 化合物6 微黄色液体，1H-NMR(400 MHz, CD3OD)δ：7.68 (2H, d,J=6.8 Hz, H-2, 6)、6.88 (2H，d，J=6.8 Hz, H-3, 5)、6.85 (1H，d，J=12.8 Hz, H-7)、5.80 (1H, d,J=12.8 Hz, H-8)、3.78 (3H, s, 4-OCH3)、4.16 (2H, q,J= 7.1 Hz, H-′)、1.25 (3H, t,J= 7.1 Hz, H-2′)。参考文献[11]报道，鉴定化合物6为顺式对甲氧基肉桂酸乙酯。

2.2.7 化合物7 淡黄色粉末，1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：7.18 (1H, d,J=1.9 Hz, H-2)、7.06 (1H, d,J=8.2, 1.8 Hz, H-6)、6.81 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5)、7.59 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7)、6.32 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-8)、3.89 (3H, s,OCH3)。以上数据与文献[13]报道对照基本一致，故鉴定化合物7为阿魏酸。

2.2.8 化合物8 无色针状晶体。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：δ7.94 (2H, d,J=8.8 Hz, H-2, 6)、6.94 (2H, d,J=8.7 Hz, H-3, 5)、3.83 (3H, s, OCH3)，以上数据与文献[14]报道对照基本一致，故鉴定化合物8为对甲氧基苯甲酸。

2.2.9 化合物9 无色油状物，有芳香味，1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：7.73(2H, m, H-3, 6)、7.62(2H, m, H-4, 5)、4.26(4H, t,J= 6.5 Hz, H-8, H-8′)、1.73 (4H, m, H-9, 9′)、1.46 (4H, m, H-10, 10′)、0.98 (6H, t,J=7.4 Hz, H-11, 11′)。13C-NMR (100 MHz)δ：169.3 (C-7, 7′)、133.6 (C-1, 2)、132.3 (C-4, 5)、129.9 (C-3, 6)、66.7 (C-8, 8′)、31.7 (C-9, 9′)、20.3 (C-10,10′)、14.0 (C-11, 11′)。以上数据与文献[15]报道对照基本一致，故鉴定化合物9为邻苯二甲酸二丁酯。

2.2.10 化合物10 无色液体，1H-NMR(400 MHz, CD3OD)δ：5.35 (2H, m, H-5, 6)、0.88 (3H, m, H-10)、1.27 (4H, m, H-3, 8, 9)、1.58 (2H, m, H-7)、2.05 (2H, m, H-4)、2.26 (2H, m, H-2)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ：176.5 (C-1)、129.1 (C-6)、127.0 (C-5)、33.4 (C-2)、38.8 (C-7)、31.5 (C-8)、26.6 (C-4)、24.6 (C-3)、22.2 (C-9)、12.9 (C-10)。以上数据与文献[16]报道对照基本一致，故鉴定化合物10鉴定为5-癸烯酸。

2.2.11 化合物11 白色固体，1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ： 2.35 (2H, t,J=7.5 Hz, H-2)、1.63 (2H, m, H-3)、1.25 (28H, m)、0.88 (3H, t,J= 6.8 Hz)。以上数据与文献[17]报道对照基本一致，故鉴定化合物11为硬脂酸。

2.2.12 化合物12 白色固体，1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ：4.22 (1H, dd,J= 11.7, 4.6 Hz, H-1a)、4.16 (1H, dd,J= 11.6, 6.1 Hz, H-1b)、3.99-3.90 (1H, m, H-2)、3.71 (1H, dd,J=11.5, 3.9 Hz, H-3a)、3.61 (1H, dd,J=11.5, 5.8 Hz, H-3b)、2.36 (2H, t,J= 7.6 Hz, H-2′)、1.67-1.59 (2H, m, H-15)、1.39-1.21 (24H, m)、0.89 (3H, t,J= 6.8 Hz, H-16′)，以上数据与文献[18]报道对照基本一致，故鉴定化合物12为单棕榈酸甘油酯。

2.2.13 化合物13 白色晶体，1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ：3.73 (1H，s, OH)、3.66 (9H, s, OCH3)、2.94 (2H, d,J=15.5 Hz, H-2)、2.82(2H, d,J=15.5 Hz, H-4)。13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ：176.6 (C-6)、 172.1(C-1, 5)、74.4 (C-3)、53.4 (C-7, 9)、44.2 (C-8)。以上数据与文献[19]报道对照基本一致，故鉴定化合物13为柠檬酸三甲酯。

2.2.14 化合物14 黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：12.47 (1H, s, 5-OH)、10.77 (1H, s, 7-OH)、10.09 (1H, s, 4′-OH)、9.37 (1H, s, 3-OH)、8.03 (2H, d,J=9.0 Hz, H-2′,6′)、6.92 (2H, d,J=9.0 Hz, H-3′, 5′)、6.18 (1H, d,J=2.1 Hz, H-6)、6.43 (1H, d,J=2.1 Hz, H-8)。以上数据与文献[20]报道对照基本一致，故鉴定化合物14为山柰酚。

2.2.15 化合物15 黄色粉末，盐酸镁粉反应阳性，1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：12.96 (1H, s, 5-OH)、10.80 (1H, s, 7-OH)、9.89 (1H, s, 4′-OH)、9.41 (1H, s, 3′-OH)、7.41 (1H, d,J=2.3 Hz, H-6′)、7.39 (1H, dd,J= 8.3, 2.3 Hz, H-2′)、6.89 (1H, d,J=8.3 Hz, H-5′)、6.43 (1H, d,J=2.0 Hz, H-8)、6.18 (1H, d,J=2.0 Hz, H-6)。以上数据与文献[21]报道对照基本一致，故鉴定化合物15为木犀草素。

3 结论

本实验从山柰中共提取分离得到15个化合物，包括芳香烃类、脂肪酸类、肉桂酸类及黄酮类等。其中，对甲氧基苯甲酸(1)、阿魏酸(7)、邻苯二甲酸二丁酯(9)、5-癸烯酸(10)、单棕榈酸甘油(12)、柠檬酸三甲酯(13) 均为首次从山柰属植物中分离得到，5-癸烯酸(10) 为首次从该植物中分离得到。查阅相关文献，在所鉴定的15个化合物中，阿魏酸(7)、山柰酚(14)、木犀草素(15) 具有显著的生物活性，如阿魏酸具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗疲劳、延缓衰老的功效[22]；山奈酚可抑制人结直肠癌RKO细胞增殖并诱导其凋亡，同时可能通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导RKO细胞自噬[23]；木犀草素可能通过抑制蛋白质丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT)/信号转导及转录活化因子3(STAT3)通路，进而抑制卵巢癌细胞增殖及侵袭、迁移能力[24]。这些成分可能是山柰发挥抗炎镇痛、抗肿瘤、抗氧化、抗血管生成的物质基础。