中药调控膝骨关节炎细胞自噬实验研究进展

岳百川 李盛华 卢冠锦 李 毅

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

膝关节骨性关节炎(osteoarthritis of the knee，KOA)是一种以膝关节疼痛、活动受限甚至功能丧失为临床表现，严重影响中老年人群生活质量和心理健康的慢性退行性疾病，临床病理学表现为关节软骨退变、骨质增生硬化和滑膜炎症[1-2]。KOA是发病率较高的骨关节退行性疾病之一，自20世纪中叶以来，膝骨关节炎的患病率已经翻倍[3]。王斌等[4]通过Meta分析，得出我国KOA患病率为18%。随着KOA患病率的逐年升高，人工膝关节置换术这一膝骨关节炎的终极治疗措施的应用也越来越成熟，但是该手术所带来的经济负担不容忽视。2019年澳大利亚骨科学会预测到2030年全膝关节置换术(total knell replacement，TKR)发生率将增加276%，与全髋关节置换术(total hip replacement,THR)共造成53.2亿澳元的医疗保健系统的成本压力[5]。此外，由于受到长期慢性疼痛和活动受限甚至是残疾的困扰，KOA患者更容易合并出现焦虑、抑郁等心理问题[6-7]。因此，对KOA的早期干预以减缓病情进展，提高患者的生活质量尤为重要。近年来，人们对自噬在KOA的发生发展过程中的作用进行了深入的研究。中药复方具有多组分、多途径、多靶点的特点，在膝骨关节炎的防治中可以起到网络化调控的作用。可以调控自噬相关基因和信号通路，影响相关蛋白的表达，对早中期KOA的治疗具有独特作用。

1 自噬相关概述

自噬是细胞死亡的生物学途径之一，对维持组织和机体内平衡起基础性作用[8-12]。当自噬受到抑制时会导致细胞死亡[13]，自噬抑制状态参与多种运动系统疾患的发病过程[14-15]。自噬过程大致可以分为自噬启动、自噬体成核、自噬小体的形成和延伸、自噬体-溶酶体融合、自噬溶酶体降解五个阶段[16-17]。自噬发挥着维持营养物质循环和代谢的重要生物学功能[18]，营养缺乏是自噬的主要启动因素，缺氧和辐射等在自噬启动中的作用也不容忽视[19]。雷帕霉素靶标(mammalian target of rapamycin,mTOR)是调控自噬的核心环节，其生物活性受PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路和AMPK信号通路和自噬相关蛋白(autophagy related protein,ATG)的调控[20]。自噬相关蛋白(ATG)在自噬过程中发挥着重要调控作用，目前已知的自噬相关蛋白有30余种[21]。PI3K/AKT/mTOR信号通路和AMPK/mTOR信号通路均与ATG1/ULK1相关，并控制磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P)的产生[22-23]。而PI3P在自噬形成过程中起关键作用[24]，可以刺激WIPI2的募集，并加速LC3的脂化[25]。LC3/ATG8家族蛋白脂化后参与子自噬体、自噬溶酶体形成等环节，是自噬的标志[26]。转化生长因子β1(transforming grawth factor β1，TGF-β1)过度表达可以降低自噬相关蛋白LC3-II/I的比例，从而抑制自噬[27]。Deng等[28]通过制作KOA动物模型，并向其膝关节内注射氯沙坦，达到过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)表达上调的效果，同时通过灭活TGF-β1信号通路，有效抑制炎症反应。以前认为ATG4蛋白仅参与LC3/ATG8的结合和解离，最新研究[29]表明ATG4家族蛋白存在独立于LC3/GABARAP的脂化系统，即通过募集含有ATG9A的囊泡促进吞噬细胞的扩大。Beclin1是自噬的主要调节因子，是Ⅲ类PI3K复合物的核心成分[30]。新的研究[31]表明VCP/p97可以间接稳定Beclin蛋白水平，当VCP活性受到抑制时会导致PI3P产生减少和早期自噬标志物WIPI2和ATG16L1的募集减少。

2 KOA与自噬

软骨退变是KOA最主要的临床病理学特征。随着年龄的增长和OA的进展，软骨中存在软骨陷窝和细胞减少，提示软骨细胞发生死亡并参与了OA的发展[32]。自噬障碍和线粒体受损会下调软骨细胞的活性[33]，激活自噬可以有效减少软骨细胞的凋亡[34]。自噬和内质网应激互为上游，共同调控细胞死亡及维持细胞稳态[13]。而当自噬受到抑制的时会促进内质网应激加剧软骨细胞凋亡及疾病进展[35]。随着软骨的逐渐退化，自噬水平也会随之降低[36]，形成恶性循环。吴献毅[37]的研究发现Beclin1、LC3A、ULK1在KOA患者关节软骨中高表达，表明自噬参与KOA的发病与修复过程。

3 中药复方及单方调控KOA自噬水平

中医学认为，膝骨关节炎的中医证型主要有气滞血瘀证、寒湿痹阻证、湿热痹阻证、肝肾亏虚证和气血虚弱证五个证型[1-2]，西医学研究表明KOA的发病与衰老密切相关，故而肝肾亏虚、筋骨失养是KOA发病的基本病机。临床辨证论治中补益肝肾、强筋壮骨类中药在大多数KOA患者中均应酌情使用。研究发现右归丸、四妙散、补肾活血方、补肾强筋胶囊、消肿止痛合剂等中药复方在调控膝骨关节炎细胞自噬水平方面具有一定优势[38-42]。颜春鲁等[38]通过右归丸干预KOA模型大鼠，发现中药组大鼠软骨组织中PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表达明显降低，Beclin1的蛋白表达明显升高，说明右归丸提高软骨细胞的自噬水平可能是通过抑制PI3K、pAkt和pmTOR和增强Beclin1的表达来实现。沈金明等[39]的研究发现四妙散能显著升高LC3的表达，并导致软骨凋亡相关蛋白Fadd、Casp3低表达，说明四妙散科通过FADD-CASP3途径激活软骨细胞自噬，控制KOA的进展。卢岩岩[40]通过用补肾活血方干预KOA模型大鼠，发现补肾活血方能使ULK1、Beclinl、LC3B、AMPK高表达，说明补肾活血方可能通过激活自噬AMPK/ULK1信号通路，抑制mTOR的表达，发挥保护软骨的作用。彭莎等[41]的研究发现补肾强筋胶囊可以提高KOA模型组大鼠软骨组织中Beclin1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、ULK1 mRNA和蛋白表达，并显著降低p-mTOR蛋白表达量，认为补肾强筋胶囊可能通过AMPK/mTOR信号通路上调KOA软骨细胞自噬。李金鹏等[42]通过运用消肿止痛合剂干预KOA模型大鼠，发现消肿止痛合剂在降低IL-6、MMP-3、COX-2、caspase-9、mTOR表达，上调LC3、Beclin1、p-AMPK的表达量方面优于硫酸氨基葡萄糖，说明消肿止痛合剂可以通过AMPK/mTOR信号通路上调软骨细胞的自噬水平，从而促进KOA软骨的修复。钱哲[43]运用网络药理学方法，发现“肝肾同治”组方调节细胞自噬是治疗KOA的途径之一。林志东等[44]的研究发现鹿茸可以上调细胞自噬基因的表达，同时下调细胞凋亡基因的表达，说明鹿茸科可通过细胞自噬、细胞凋亡清除受损的细胞器和蛋白质，起到维持细胞内环境稳态，保护关节软骨的作用。

虽然目前在中药干预KOA软骨自噬方面进行了较多的研究，但是受限于中药复方成分复杂的原因导致对于机制的深入研究较为困难，也不能排除中药通过其他途径干预软骨细胞自噬，仍然需要进一步创新中医药研究方法。

4 中药单体调控KOA自噬水平

随着生物信息学尤其是网络药理学的发展，为人们通过已发表文献中筛选中药有效成分和靶点信息提供了便捷的途径。中药单体以其成分单一、便于研究的特点被大量应用于KOA防治的基础研究和临床研究。研究[45-46]表明，淫羊藿苷能显著上调Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ULK1、FIP200、ATG13蛋白的表达进而影响自噬水平。青藤碱是一种主要存在于中药青风藤的生物碱，具有抗炎镇痛等多种生物学作用[47]。郑洁等[48]观察不同剂量的青藤碱干预KOA兔关节软骨自噬水平，发现青藤碱能显著下调关节软骨中Atg-5、Atg-12的mRNA表达和Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达，同时发现青藤碱能显著上调PI3K/akt/mTOR信号通路中PI3K、akt和mTOR的表达，说明青藤碱通过抑制PI3K/akt/mTOR信号通路，上调KOA兔关节软骨自噬水平。商连斌等[49]通过检测续断总皂苷干预的KOA模型大鼠，发现续断总皂苷组大鼠软骨组织中p-PI3K、P-akt、p-mTOR的表达水平显著降低，镜下观察发现该组大鼠软骨病理损伤较轻，说明续断总皂苷可抑制PI3K/akt/mTOR信号通路，上调软骨细胞自噬水平保护关节软骨；另一项研究[50]通过检测续断总皂苷干预KOA模型大鼠软骨组织中Atg3、Atg4、Atg7表达水平，发现三者均显著降低，进一步证实了续断总皂苷可以激活软骨细胞自噬保护关节软骨。

5 小结与展望

自噬是维持关节软骨细胞稳态的重要生物学机制之一，自噬活性降低则不能及时清除受损的细胞器和蛋白质，导致软骨修复缺乏必要的物质基础和能量，使软骨细胞减少，最终软骨退变。

目前尚未开发出调控软骨自噬扭转KOA进展的药物，中医药具有多成分、多靶点等优势。辨证用药是中医药创新发展的核心，今后的研究中既不能放弃中药复方网络化调节的优势，又要借助中药单体的研究帮助明确其作用机制。未来应该坚持创新中医药科研方法，让现代分子生物学理论更好地契合中医药理论。充分发挥中药尤其是中药复方干预KOA软骨自噬的优势，以期为中医药防治KOA提供理论依据和研究方向。