miRNA 对激素敏感型特发性肾病综合征患儿调节性T 细胞的影响探讨

刘光磊

INS 是小儿常见的肾脏疾病,以大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和浮肿为其临床特征［1］。微小病变型肾病为INS 主要原因,本病发病机制仍不清楚,对糖皮质激素及实验研究提示本病为免疫介导［2］,但其中的因果关系尚待进一步探讨。近年来有研究发现INS患儿外周血中Treg 比例下调［3］,但导致Treg 细胞比例下调的机制仍不清楚,需进一步研究,本文系统观察急性期和缓解期INS 患儿Treg 细胞比例和Th2 细胞比例动态变化,检测参与调控Treg 细胞分化的miRNA 变化,旨在进一步阐明INS 发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019 年1 月～2021 年12 月本院治疗的40 例激素敏感型INS 患儿为研究对象,其中男27 例,女13 例；平均年龄(39.0±10)个月。根据病情将患儿分为INS 初发组和INS 缓解组,各20 例。另选取同年龄健康体检儿童20 例作为对照组。三组性别、年龄等一般资料比较,差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。见表1。本研究已通过遵义医科大学第五附属(珠海)医院伦理委员会批准,所有研究对象的监护人均已知情和同意。

表1 三组一般资料比较［n(%),］

表1 三组一般资料比较［n(%),］

注：三组比较,P＞0.05

1.2 纳入、排除及诊断标准 纳入标准：符合INS 的诊断标准；激素敏感型INS 患儿。排除标准：先天性肾病综合征、狼疮性肾炎及紫癜性肾炎等继发性肾病综合征、肾炎性肾病综合征。诊断标准：①INS 诊断标准：根据2016 年《儿童激素敏感、复发/依赖肾病综合征诊治循证指南》对INS 进行诊断［4］；②激素敏感型INS：是指采用足量强的松,未使用其他免疫抑制剂联合治疗,并且治疗8 周内尿蛋白转阴的INS；③INS 初发患儿：是首次患病的INS 患儿；④INS 缓解患儿：停用强的松治疗＞4 周,并且血液生化监测指标及尿液常规检查均正常的INS 患儿。

1.3 方法 INS 初发患儿在应用激素前、缓解患儿在达到缓解标准后4 周、对照组在健康体检时均于肘部一次性抽取静脉血3 ml 进行以下检测。①采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测受试儿外周血单个核细胞(PBMC)中循环Treg 细胞比例：以CD4-FITC(流式抗体均购自美国eBio-science 公司)设门,经CD4-FITC、CD25-APC 染色30 min 后经固定破膜后加入Foxp3-PE,孵育30 min 后上机检测Treg。②实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测miRNA：按试剂盒说明书(美国Invitrogen 公司)步骤分离T淋巴细胞总RNA,紫外分光光度计测定RNA 含量及纯 度SYBRGreen 试剂盒(德国QIAGen,218073),罗氏(Light Cycler 480)PCR 仪荧光定量检测miRNA155、miRNA21、miRNA31 的表达。

1.4 观察指标 比较外周血中Treg 细胞百分比、Th2细胞百分比及Treg 分化相关miRNA(miRNA155 基因、miRNA21 基因、miRNA31 基因)水平。分析外周血Treg、Th2 细胞百分比的相关性。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,正态计量资料采用t检验,非正态计量资料采用F检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验；相关性采用Pearson相关分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组Treg 细胞百分比及Treg 分化相关miRNA表达水平比较 INS 初发组患儿外周血Treg 细胞百分比(3.45±1.88)% 低于对照组的(5.99±2.01)%及INS 缓解组的(5.62±1.44)%,差异均有统计学意义(P＜0.05)；INS 初发组患儿外周血Th2 细胞百分比(4.58±1.35)% 高于对照组的(3.43±1.03)% 及INS 缓解组的(3.69±1.24)%,差异均有统计学意义(P＜0.05)；INS 初发组患儿miRNA155 基因表达(27.70±12.30)×10-5低于对照组的(51.62±18.70)×10-5及INS缓解组的(36.36±16.10)×10-5,差异均有统计学意义(P＜0.05)；INS 缓解组与对照组miRNA155 基因表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；INS 初发组患儿miRNA21 基因表达(15.88±3.58)×10-5低于对照组的(26.04±4.54)×10-5及INS缓解组的(23.09±4.29)×10-5,差异均有统计学意义(P＜0.05)；INS 缓解组与对照组miRNA21 基因表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；INS 初发组患儿miRNA31 基因表达(20.63±6.45)×10-5高于对照组的(13.37±4.38)×10-5及INS 缓解组的(15.47±3.29)×10-5,差异均有统计学意义(P＜0.05)；INS 缓解组与对照组miRNA31 基因表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 三组外周血Treg、Th2 细胞百分比及相关miRNA 表达水平比较()

表2 三组外周血Treg、Th2 细胞百分比及相关miRNA 表达水平比较()

注：与INS 初发组比较,aP＜0.05

2.2 外周血Treg、Th2 细胞百分比的相关性分析 相关性分析结果显示,外周血Treg 百分比与Th2 细胞百分比呈负相关关系(r=-0.527,P＜0.05)。见图1。

图1 外周血Treg 细胞百分比与Th2 细胞百分比关系散点图

3 讨论

INS 发病多为学龄期前儿童,3～5 岁为发病高峰,约80%～90%年龄＜10 岁的INS 患儿属于微小病变型［1］。本病发病机制仍不清楚,对糖皮质激素及实验研究提示本病为免疫介导特别是T 细胞的功能异常所致［2］。早在1959 年就有报道,花粉过敏症与季节性蛋白尿的关系［5］,并且约30%的INS 患儿合并有过敏鼻炎、特发性皮炎等特应性表现,部分研究还证实INS患儿活动期免疫球蛋白(Ig)E 增高,特别是反复复发患儿更为明显［6］。已知Th2 分泌的白细胞介素(IL)-13、IL-4 促进B 细胞IgE 的产生,在过敏反应中发挥重要作用。并且近年来有研究表明,活动期INS 患儿外周血中Th2 比例升高、血浆中IL-13、IL-4 浓度增高［7］。

众所周知,Treg 细胞在免疫系统中发挥着免疫调节功能,对Th2 细胞等有抑制作用［8,9］。且以往已有报道INS 急性期Treg 比例下调［3］,并且2011 年Michiko等提出二次打击学说,即血清IL-13、内毒素或抗原等作用于肾小球,导致足细胞CD80 的过表达,进而出现暂时蛋白尿,此为第一次打击,如果此时能够解除对足细胞的刺激因素,抑制CD80 的过分表达,尿蛋白将会消失,但INS 患儿由于Treg 下调,不能分泌足够的可溶性细胞毒性T 淋巴相关抗原(sCTLA-4)、IL-10 等抑制CD80 表达的细胞因子,导致CD80 的持续过表达,进而出现持续蛋白尿的产生,此为第二打击［10］。因此本文进一步检测了各组外周血中Treg 细胞比例和Th2细胞的比例,结果表明,初发期INS 患儿外周血中Treg细胞比例呈明显下降趋势,而初发期患儿Th2 细胞比例均明显增高。而在在缓解期INS 患儿,Treg 细胞比例呈明显上升趋势,Th2 细胞比例均明显下降,这与以往的研究结果相同［7］。而进一步通过相关关系分析发现,各组外周血Treg 细胞与Th2 细胞比例之间呈明显负相关关系(P＜0.05),也就是说随着Treg 细胞比例的下降,Th2 细胞呈明显上升趋势,因此Treg 细胞比例下降可能INS 发病的重要原因。

早期有学者认为Treg 细胞的下降可能与细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-2 的紊乱有关,但研究表明,INS 患儿血浆中TNF-α 呈增高趋势,而IL-1β、IL-2 是否增高仍存在争议,因此通过体液中细胞因子的改变解释Treg 下降证据尚不充分［11-13］,何种原因导致Treg 下降仍需进一步探讨。

miRNA 是一种内源性的、非编码蛋白质的单链小分子RNA,通过干扰靶向信使RNA(mRNA)的稳定或翻译抑制蛋白质的合成,从而调控基因表达［14］。研究已证实miRNA155、miRNA21 信号途径和miRNA31可分别上调或下调Treg 特异性标志之一的Foxp3 表达［15,16］,而Foxp3 是Treg 发育的重要调节因子,因此,miRNA155、miRNA21 信号途径和miRNA31 可能共同参与调控Treg 细胞［17-20］。因此本文进一步检测参与调控Treg 细胞分化的miRNA,结果提示在活动期INS 患儿中,上调Treg 细胞功能的miRNA155、miRNA21 呈明显下降趋势,而下调Treg 细胞功能的miRNA31 则呈明显上升趋势,提示Treg 细胞比例下降可能与miRNA155、miRNA21、miRNA31 的异常表达有关。本研究显示,恢复期INS 患儿Treg 细胞比例、Th2 细胞比例已恢复到接近正常水平,而miRNA155、miRNA21 基因表达也下调至接近正常对照组的水平,而同时miRNA31 基因表达也上调至接近正常对照组的水平,表明初发期INS 患儿 miRNA 表达异常可能是导致急性期Treg 细胞数量下调的原因之一。

综上所述,初发期INS 患儿Treg 细胞下调可能与miRNA 的异常表达有关,由于研究方法与对象的局限,INS 患儿Treg 细胞相关miRNA 异常表达的具体机制尚需进一步研究。