门冬胰岛素生物活性测定方法学研究

刘璐 匡荣 虞佳涛 李墨池 张劲松

糖尿病是全球性的慢性疾病,患者由于缺乏胰岛素分泌减少或者产生耐受,导致血糖代谢紊乱,形成高血糖症。目前,治疗糖尿病主要方式是口服降糖药和注射胰岛素,而对于胰岛素起效作用而言,分为长效、中效、短效和速效胰岛素,市场上主要的胰岛素产品有德谷胰岛素、门冬胰岛素,门冬胰岛素是用生物技术将人胰岛素氨基酸链B28 位的脯氨酸由天门冬氨酸替代而成的,具有降血糖作用,注射后15 min 起效,作用可持续 3～5 h。门冬胰岛素的降血糖作用是通过其分子与肌肉和脂肪细胞上的胰岛素受体结合后,促进细胞对葡萄糖吸收利用,同时抑制肝脏葡萄糖的输出来实现的。临床数据表明,通过安全性药理学、重复给药毒性、遗传毒性和生殖毒性的常规试验发现,门冬胰岛素对人体没有特殊危险。在体外试验中,包括与胰岛素和胰岛素样生长因子-1 受体的结合,以及对细胞生长的影响,门冬胰岛素的表现与人胰岛素非常相似［1-6］。因此,门冬胰岛素的有效性研究成为产品质量控制的关键,主要体现在其生物活性/效价的控制,也有通过液相、超高液相方法测定门冬胰岛素的含量方法,两者结合精确度更高,本研究根据中国药典对门冬胰岛素测定方法进行规范的验证,用门冬胰岛素标准品,以小鼠为载体,建立门冬胰岛素生物活性测定方法［7-10］,确保测定方法的可行性,为产品优化提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 120 只雌性ICR 小鼠,无特定病原体(SPF)级,体重20～26 g,购自上海吉辉实验动物饲养有限公司,动物生产许可证：SCXK(沪)2017-0012,动物实验室：浙江省食品药品检验研究院,动物使用许可证：SYXK(浙)2021-0016,所有动物的使用均经过实验动物使用和管理委员会(IACUC)批准,IACUC 编号为2021-010。饲料为Co60 辐照实验鼠维持饲料,购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司,生产许可证号：苏饲证(2019)01008。动物饲养期间,自由摄食和饮水。

1.2 药物与试剂 门冬胰岛素标准品(中国食品药品检定研究院,批号：410011-201902,效价：27.4 U/mg)。氯化钠(国药集团化学试剂有限公司,批号：20200915),苯酚(国药集团化学试剂有限公司,批号：20200508),三氯乙酸(南京化学试剂股份有限公司,批号：181017238C),盐酸(杭州天动力化学品有限公司,批号：20201104),葡萄糖测定试剂盒 (德国德赛诊断系统有限公司,批号：29204)。

1.3 主要仪器 日立7180 型自动生化分析仪(日本日立公司),ME2002E 型电子天平(METLER TOLEDO),XPR305 型天平(METLER TOLEDO),TD1200 型电子天平(宁波金诺天平仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 供试液的制备 实验当天取一定量的门冬胰岛素标准品,用pH=2.5(含苯酚)的生理盐水配成20 U/ml的母液,取母液用pH=2.5 的生理盐水分别配制成0.08 U/ml、0.04 U/ml,0.1 U/ml、0.05 U/ml,0.125 U/ml、0.0625 U/ml 门冬胰岛素溶液,相当于80%,100%,125%效价水平高低浓度的待测溶液,标准品溶液浓度高低剂量浓度为0.1 U/ml、0.05 U/ml。

2.2 动物分组及给药 120 只小鼠,随机分成A1 组、B1 组、C1 组、D1 组、A2 组、B2 组、C2 组、D2 组、A3 组、B3 组、C3 组、D3 组,每组10 只。四组为一批,分别用门冬胰岛素标准品进行80%、100%、125%效价水平测定。组间平均体重差＜3 g,逐只编号,按ds1、ds2、dT1、dT2 顺序分别自皮下注入标准品或供试品稀释液,0.2 ml/鼠,每只间隔1 min,注射后40 min 按给药顺序分别自眼静脉丛采血,采血后取0.06 ml 加至含0.36 ml 三氯乙酸的EP 管中,以2500 r/min 速率离心15 min,取上清液,用生化分析仪测定血糖值。按双交叉设计,第2 次给样按dT2、dT1、ds2、ds1 顺序进行,并测定给样后40 min 的血糖值。2 次间隔给药时间4 h,照生物检定统计法(通则1431)中量反应平行线测定双交叉设计法计算效价及实验误差。按上述方法重复实验2 次,给药方案见表1。依据中国药典2020 版通则9401 生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则,对实验相对准确度、中间精密度、线性和范围进行评估。

表1 门冬胰岛素给样方案

2.3 样品测定 根据建立的实验方法,分别测定3 批门冬胰岛素标准品及3 批门冬胰岛素供试品稀释液生物效价。

2.4 数据处理与统计学方法 所得数据录入BS2000生物检定软件中统计,依据中国药典2020 版(通则1431)中量反应平行线测定双交叉设计法,BS2000 中分别计算80%、100%、125%效价水平试验所测得的待测溶液生物活性和试验误差。80%、125%效价水平试验可靠性测验结果判定要求为：回归F检验显著(P＜0.05),偏离平行F检验不显著(P＞0.05)；100%效价水平试验可靠性测验结果判定要求为：回归F检验显著(P＜0.05)；偏离平行、试品间F检验不显著(P＞0.05)。可信限率(FL)≤25%。相对准确度：相对偏差：(RB)=(效价测定值/效价理论值-1)×100%。中间精密度：几何标准偏差(GSD)=antilog (SD),式中,SD 为每个效价水平效价测定值的对数标准偏差。GCV=(GSD-1)×100%。线性：以效价理论值的对数(横坐标)对其相应的效价测定值的对数(纵坐标)作图,采用最小二乘法进行线性回归。并列出直线回归方程、及相关系数。范围：相对准确度、中间精密度和线性均符合要求的效价水平范围满足生物活性检定质量标准的要求。

3 实验结果

3.1 不同效价水平测试结果 80%、125% 效价水平试验可靠性测验回归F检验显著(P＜0.05),偏离平行F检验不显著(P＞0.05)；100%效价水平试验可靠性测验回归F检验显著(P＜0.05)；偏离平行、试品间F检验不显著(P＞0.05)。可信限率＜25%。见表2。

表2 不同效价水平测试结果(%)

3.2 相对准确度验证结果 不同效价水平测定值的相对偏差均在±20%范围内。见表3。

表3 不同效价水平相对准确度测试结果

3.3 中间精密度验证结果 80%、100%、125%效价水平测定值的GCV 均＜20%。见表4。

表4 不同效价水平中间精密度验证结果

3.4 线性验证结果 以效价理论值的对数(横坐标)对其相应的效价测定值的对数(纵坐标)做图如下。采用最小二乘法进行线性回归,拟合的直线回归方程为Y=1.012X+0.0169,相关系数为0.9940。见图1。

图1 线性曲线

3.5 范围 实验中相对准确度、中间精密度和线性均符合要求,效价水平范围为理论值的80%～125%,即21.92～34.20 U/mg,满足生物活性检定质量标准的要求。

3.6 6 批样品生物效价测定结果 取6 批样品(批号：20210524、202006009、202006010、202104001、202104002、202104003)分别同法测定,各批样品的测定结果见表5。实验结果表明6 批样品的可靠性测验回归F检验显著(P＜0.05),偏离平行F检验不显著(P＞0.05),试品间F检验不显著(P＞0.05),可信限率均＜25%,均符合要求。见表5。

表5 6 批样品生物效价测定结果

4 讨论

选用ICR 小鼠进行实验,用门冬胰岛素标准品配制成80%、100%、125%的效价水平测定活性,研究发现,动物状态对实验结果较大,组内选择动物体重控制在2 g 范围内实验成功率高,本研究选用全自动生化分析仪进行血糖测定,相对于血糖仪比较,测定过程较为复杂,实验结果不确定性高,但准确度高,本试验室统计本实验成功率约为60%,关注实验过程中给样是否存在漏液,严格控制给样时间和取血时间,保障实验成功率。

本实验采用小鼠血糖法测定门冬胰岛素生物活性,对其相对准确度、中间精密度、线性和范围进行考察,结果表明建立的方法符合指导原则和生物活性检定质量标准的要求,可作为门冬胰岛素活性测定方法,表明建立的方法是可靠的。