黑色素瘤来源的外泌体miR-23a 在黑色素瘤达拉非尼耐药中的机制研究

罗单

恶性黑色素瘤 (malignant melanoma,MM) 是一种起源于黑色素细胞或黑色素细胞源性细胞的皮肤肿瘤［1］。尽管恶性黑色素瘤仅占所有皮肤肿瘤的小部分,但由于其不良的预后和较高的死亡率(占所有皮肤癌死亡人数的65%),目前已经成为全世界最具侵害性和最易致命的皮肤癌之一,同时也是全球人类健康不容忽视的危害。达拉非尼是一种已经被批准使用于治疗Ⅲ/Ⅳ期和转移性恶性黑色素瘤的小分子靶向药物,但是根据多项报道认为,恶性黑色素瘤患者在服药以后会较快出现耐药性,因此对于临床效果来说是有一定限制的［2］。实际上,目前很多专家认为耐药性已经成为了治疗恶性黑色素瘤的主要挑战之一,因此要找到耐药机制。当然,癌症的耐药机制是复杂多元化的,很多研究认为主要原因就是机体氧化应激反应、细胞自噬与凋亡,以及遗传的不稳定性所导致的［3,4］。本研究从自噬角度出发,对黑色素瘤来源的外泌体miR-23a 在黑色素瘤达拉非尼耐药中的机制进行分析和研究。

1 材料与方法

1.1 材料 购买的细胞为美国American Type Culture Collection 的恶性黑色素瘤细胞系A375；所用主要实验试剂包含如下：美国Sigma-Aldrich 公司的达拉非尼,美国Cell Signaling Technology 生产的抗裂解PARP、抗LC3Ⅰ/Ⅱ和物种特异性二抗,美国LI-COR Biosciences公司生产的DMEM 培养基,美国Thermo Fisher Scientific 公司生产的胎牛血清和双抗；所用主要仪器设备包含如下：美国Nikon 公司生产的PCM 2000 共聚焦显微镜,上海力申公司生产的台式高速离心机,美国BioTek 公司生产的酶标仪,美国伯乐公司生产的蛋白电泳仪、SDS-PAGE 凝胶电泳仪,上海培清科技有限公司生产的化学发光仪。

1.2 方法

1.2.1 达拉非尼处理 选择恶性黑色素瘤细胞系A375,再用(0、30、100、300 nM)浓度的达拉非尼对其进行24 h 处理。

1.2.2 模拟物转染 将miR-23a 模拟物转染到达拉非尼耐药性最强的A375 细胞株上,使其呈现miR-23a过表达。将A375 细胞株在6 孔培养板中接种,每个孔中为对数生长期的细胞20 万个,细胞生长融合到60%左右就进行转染操作,取其中A 管加入miR-23a mimics(miR-23a 组),然后按照细胞培养条件进行培养,取B 管加入15 μl 脂质体Lipofectamine2000,按照细胞培养条件进行培养。两组均培养48 h 以后对细胞的上清液加以收集。

1.2.3 利用Western Blot 和qPCR 检测处理前后A375 细胞中的LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 等表达水平 qPCR 检测miR-23a 表达,首先提取外周血单核血细胞中的总RNA,把组织样本放在室温环境下静置5 min,然后放入A 组各管里面进行震荡混匀,在室温下孵育20 min。在培养板的细胞中,分别均匀滴入上述转染混合液,并慢慢摇匀,在37℃培养箱中孵育过夜。然后根据TaKaRa 公司的反转录试剂盒操作说明书进行具体操作。

Western Blot 检测LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表达蛋白水平,严格按照操作说明书进行操作,并将印记膜接触胶片,根据荧光强弱进行不同的曝光,12 h 后洗片,然后用图像分析软件进行灰度值的分析,以及参用内参灰度值对蛋白相对含量进行比较。

1.3 观察指标 ①检测和比较恶性黑色素瘤细胞内被用不同浓度的达拉非尼处理前后LC3Ⅰ/Ⅱ表达的水平。②检测和比较耐药恶性黑色素瘤细胞内被转染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表达的水平。③分析miR-23a 与耐药相关通路上各个因子的相关性。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验；相关性检验采用Pearson 线性相关分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 达拉非尼处理前后A375 细胞系中LC3Ⅰ/Ⅱ的表达 将A375 细胞系用不同浓度的达拉非尼(0、30、100、300 nM) 处理,收集细胞。经Western Blot检测LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达水平,并行qPCR 分析,发现LC3Ⅰ/Ⅱ水平随达拉非尼浓度的升高而增加,说明达拉非尼以剂量依赖性方式显著激活了自噬信号。见图1。

图1 LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表达水平WB 图

2.2 耐药恶性黑色素瘤细胞内被转染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表达水平 转染后,miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 的 表达水平均高于转染前,差异具有统计学意义 (P＜0.05)。见表1。

表1 耐药恶性黑色素瘤细胞内被转染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表达水平比较()

表1 耐药恶性黑色素瘤细胞内被转染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表达水平比较()

注：与转染前比较,aP＜0.05

2.3 miR-23a 与耐药相关通路上各个因子的相关性分析 Pearson 线性相关分析结果显示,miR-23a 表达水平与caspase-3、TNF-α、caspase-8、TGF-β、LC3Ⅰ/Ⅱ呈正相关(P＜0.05),与ROS 无相关性(P＞0.05)。见表2。

表2 miR-23a 与耐药相关通路上各个因子的相关性分析

3 讨论

黑色素瘤是一种具有高侵袭性及死亡率的恶性肿瘤,早期诊断并通过手术切除可以达到较好的临床预后,而发生转移的黑色素瘤由于缺乏有效的治疗手段,生存率极低。我国较多患者都受到疾病意识、经济和医疗因素的影响导致诊断的时候已经有不同程度的转移,所以对黑色素瘤的早期识别,以及对有效的晚期治疗途径的寻找就显得比较重要［5］。目前达拉非尼已经被认为是治疗转移性黑色素瘤的一线化疗药物,50%～60%接受达拉非尼治疗的患者可以显著延长无进展生存期和总生存期。尽管,达拉非尼拥有如此良好的疗效,但对于药物的耐受限制了患者的长期有效治疗。外泌体是由多种类型细胞分泌的一种细胞外囊泡,通过其载体作用将内容物从分泌细胞转移到受体细胞以实现细胞间的通信交流。基于其独特的生物特性和功能,外泌体已被应用于黑色素瘤的诊断、治疗和预后评价等方面［6］。达拉非尼是一种新型的治疗黑色素瘤的有效药物,可以通过阻止BRAF 基因突变缩小黑色素瘤。这类靶向药物可以明显延长BRAF 基因突变的黑色素瘤患者的生存时间,然而大部分患者会产生一定的达拉非尼耐药,而导致肿瘤继续生长。因此对外泌体调控黑色素瘤的发病机制与达拉非尼耐药的研究更突显其意义。miRNA-23a 是存在脊椎动物的基因组中的一种抑癌因子,可参与基因转录后表达调控,从而抑制肿瘤细胞增殖、侵袭,其表达量在乳腺癌、小细胞性肺癌、肝细胞癌、胶质瘤等多种恶性肿瘤的诊断及预后评估中具有重要的参考价值。已报道miRNA-23a 在黑色素瘤中的转移和复发中存在异常,而且已被证实可以通过外泌体分泌至肿瘤环境中,但其调节黑色素瘤进展的具体机制相关研究很少。

黑色素瘤耐药研究中,细胞凋亡和自噬研究历来是焦点和重点,其中细胞自噬可以降解细胞浆内的许多物质,比如细胞质、蛋白和一些大分子物质,将其传递到溶酶体,然后进行降解。

整个清除过程主要是为了细胞稳态得到保持,并使得细胞的氧化应激损伤得到保护,提高细胞的自噬活性关系到多种癌症细胞的存活情况［7］。迄今为止,已经能够支持靶向疗法耐药中,自噬占据重要地位的证据有很多［8］。凋亡作为程序性细胞死亡形式之一可以有序、有效的清除受损细胞,而癌症的发生大部分与细胞凋亡机制失去平衡有着明显的关系,凋亡不仅仅是肿瘤发生和发展的标志性事件,而且还与肿瘤对药物的抵抗有着很大的关系［9］。LC3 合成前体LC3(pro-LC3),然后其末端被水解切割后失去多肽使得甘氨酸发生暴露,成为了LC3-Ⅰ。在细胞自噬的过程中,LC3-Ⅰ扮演着重要角色,其在ATG7、ATG12-ATG5-ATG16L 作用下结合磷脂酰乙醇胺组成了LC3-Ⅱ,其因为被修饰因此电荷发生变化而形成更快的迁移率。本研究选择恶性黑色素瘤细胞系A375,再用(0、30、100、300 nM)浓度的达拉非尼对其进行24 h 处理,结果发现LC3Ⅰ/Ⅱ水平随达拉非尼浓度的升高而增加；然后再用miR-23a 模拟物转染对300 nM 的A375 细胞进行转染,利用Western Blot 和qPCR 检测转染前后A375 细胞中的miR-23、LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 等表达水平。发现转染后,miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 的表达水平均高于转染前,差异具有统计学意义 (P＜0.05)。Pearson 线性相关分析结果显示,miR-23a 表达水平与caspase-3、TNF-α、caspase-8、TGF-β、LC3Ⅰ/Ⅱ呈正相关(P＜0.05),与ROS 无相关性(P＞0.05)。在细胞凋亡通路中,细胞内的Ca2+浓度升高后,氧化损伤会引起羟自由基等ROS、毒素、一氧化氮(NO)、生长因素和激素刺激等［3］发生异常改变,并会对caspase-8发生激活后引起caspase 级联反应,从而细胞凋亡开始,因此本研究结果提示了miR-23a 表达水平与caspase通路相关,从而继发了细胞凋亡通路,也可能是通过这一路径,因为导致了黑色素瘤达拉非尼的耐药发生。

综上所述,达拉非尼耐药恶性黑色素瘤细胞A375,相比于处理前,其LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表达显著上调；达拉非尼耐药恶性黑色素瘤细胞中的miR-23a 表达水平上调后,能够促使耐药细胞发生自噬而导致凋亡加速,这可能就是miR-23a 在黑色素瘤达拉非尼耐药中发生影响的可能机制。