脓毒症急性肾损伤患者血清miR-125b-5p 的表达水平及意义

陶伍元 邓柳霞 李晓萍

作者单位：518101 广东深圳，深圳市宝安区人民医院急诊科（陶伍元、李晓萍），肾内科（邓柳霞）

脓毒症致患者器官功能损伤中以急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）为常见。脓毒症急性肾损伤（septic acute kidney injury，SAKI）的发病机制较复杂，有研究显示，微小RNA（microRNA，miRNA）参与SAKI 的发生发展。本研究通过对SAKI 患者血清中的miRNA 进行测序分析，同时进行京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，探讨miR-125b-5p在SAKI患者血清中的水平变化及其与血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）水平的相关性，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组 选择2019 年6 月—2021 年12 月深圳市宝安区人民医院急诊科收治的38 例SAKI 患者作为研究对象，另外选择同期40 名健康体检者作为对照组。

1.1.1 纳入标准 ① 年龄18～70岁，符合2016版脓毒症与脓毒性休克国际处理指南的诊断标准，即存在感染或可疑感染，且序贯器官衰竭评分（sequential organ failure assessment，SOFA）≥2 分；② 符合肾脏疾病预后组织指南的AKI 诊断标准：48 h 血肌酐（serum creatinine，SCr）上升≥26.5 mmol/L 或7 d 内SCr＞1.5 倍基线值，连续6 h 尿量＜0.5 mL·kg-1·h-1；③ 病例资料完整。

1.1.2 排除标准 ① 既往有严重慢性病（糖尿病、恶性肿瘤、慢性肾功能不全、慢性心力衰竭）病史；② 长期使用糖皮质激素；③ 临床资料不全。

1.1.3 伦理学 本研究符合医学伦理学标准，并经本院伦理审批（审批号：2019JD032），所有检测均获得过患者或家属的知情同意。

1.2 仪器与试剂 Rayto RT-6100 全自动酶标分析仪购自深圳雷度公司，实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪购自美国ABI公司，Nanodrop 分光光度计和台式冷冻高速离心机购自美国Thermo 公司，Agilent 2100 生物分析仪购自美国安捷伦公司，Hiseq 2500 测序仪和TruSeq Small RNA 建库试剂盒均购自美国Illumina 公司。miRNeasy RNA 提取试剂盒购自美国QIAGEN 公司，人VE-cadherin 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，反转录试剂盒、TB Green qPCR 试剂盒、DEPC 水均购自日本TAKARA 公司，miRNA 茎环法反转录试剂盒购自美国EZB 生物公司，Trizol 购自美国Invitrogen 公司，三氯甲烷购自上海试剂一厂，异丙醇购自中国医药集团有限公司。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 两组血清miRNA 测序分析 血浆总RNA 提取：采用miRNeasy Kit 试剂盒提取RNA，根据说明书操作分离和纯化样品总RNA，检测RNA 的完整性。参照试剂盒说明书构建小RNA 文库，具体过程为：3'接头序列连接，5'接头序列连接，反转录生成cDNA 链，PCR 扩增，电泳纯化目的片段。采用Agilent 2100 生物分析仪进行质量检验，合格后采用Hiseq2500 测序仪进行测序，读长为1×50 bp。

1.3.2 采用实时定量荧光PCR 法检测miR-125b-5p表达 取200 μL 血清置于1.5 mL 离心管中，加入800 μL Trizol 试剂混匀。按照反转录试剂盒说明书，采用两步法将RNA 反转录成cDNA，采用实时定量PCR 试剂盒进行cDNA 扩增，PCR 引物由上海生工有限公司合成。见表1。反应条件：95 ℃ 90 s；95 ℃30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40 个循环。以cel-miR-39-3p 为内参基因，对miR-125b-5p 的相对表达水平进行定量检测，通过2-△△CT值进行计算，对各组数值进行统计分析。

表1 引物序列

1.3.3 ELISA 检测两组血清VE-cadherin 水平 采集两组患者静脉血4 mL，以2 000 r/min 离心10 min提取血清，于-80 ℃冰箱保存。取血清100 μL，采用ELISA 法检测血清中VE-cadherin 水平，按照试剂盒和相关仪器说明书进行操作。

1.4 统计学分析 采用SPSS 26.0 统计软件分析数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两两比较采用t检验；计数资料以例（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 两组研究对象性别、年龄、体质量指数（body mass index，BMI）等一般资料比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），有可比性。见表2。SAKI 组中感染来源分别为腹腔感染6 例，泌尿系统感染8 例，肺部感染8 例，胆道感染6 例，肠道感染3 例，软组织感染4 例，血液循环系统感染3 例。

表2 对照组与SAKI 组的一般资料比较

2.2 两组患者血清miRNA 测序分析结果比较SAKI 组血清中有33 种miRNA 表达水平明显高于对照组，23 种miRNA 表达水平明显低于对照组；SAKI组miR-125b-5p 表达水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图1。

图1 两组血清miR-125b-5p 测序分析结果比较

2.3 两组血清miRNA-125b-5p 表达水平比较 实时荧光定量PCR 法检测结果显示，SAKI 组患者血清中miRNA-125b-5p 表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 两组血清VE-cadherin 水平比较 SAKI 组患者血清VE-cadherin 水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 对照组与SAKI 组血清miR-125b-5p 表达和VE-cadherin 水平比较（±s）

表3 对照组与SAKI 组血清miR-125b-5p 表达和VE-cadherin 水平比较（±s）

注：SAKI 为脓毒症急性肾损伤，VE-cadherin 为血管内皮钙黏蛋白

组别 例数（例） miR-125b-5p VE-cadherin（mg/L）对照组 40 1.25±0.21 15.54±4.78 SAKI 组 38 3.65±0.39 22.39±5.24 t 值 19.880 5.852 P 值 0.001 0.001

2.5 KEGG 富集分析 KEGG 信号通路富集分析结果显示，靶基因显著富集于乳头瘤病毒感染、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylin-ositol-3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信号通路、肌动蛋白骨架调节、丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信号通路等。见图2。

图2 KEGG 富集分析图

2.6 血清VE-cadherin 与miR-125b-5p 的相关性Pearson 相关分析表明，血清中VE-cadherin 与miR-125b-5p 水平呈正相关，r值为0.743，P值为0.001。

3 讨论

AKI 在临床多发，且病死率较高，全球每年约有1 300 万名AKI 患者［1］。重症监护病房（intensive care unit，ICU）患者AKI 发生率为30.4%～60.0%［2-3］。AKI 的常见病因主要有感染、休克、药物、手术、应激等，其中脓毒症患者的AKI 发病率高达40%～70%［4］。近年来研究表明，脓毒症可导致血管内皮损伤，从而造成AKI 的发生［5］。

VE-cadherin 是一种内皮细胞紧密连接蛋白，在维持内皮细胞屏障功能中具有决定性作用［6］。脓毒症造成的炎症级联反应可损伤VE-cadherin 在内皮细胞膜上的紧密连接，破坏内皮细胞的间隙，从而导致细胞通透性增大，毛细血管渗漏，造成微循环障碍［7-8］。本课题组前期动物实验研究表明，脓毒症实验动物肾组织中VE-cadherin 蛋白表达减少，促进SAKI 的发生发展。

miRNA 是一种内源性非编码单链RNA，参与转录后基因表达调控。目前关于miRNA 在SAKI 中的研究甚少，国外有文献报道，miR-34a 和miR-21可参与SAKI 的调控［9-10］。近年来关于miRNA 参与SAKI 发生发展的文献较少。利用Targetscan 软件预测VE-cadherin 可能作为miR-125-5p 的靶基因。

本研究结果显示：① 与对照组比较，SAKI 患者血清miRNA-125b-5p 呈高表达，且差异有统计学意义；通过实时荧光定量PCR 验证了这一结果，因此miR-125b-5p 表达的升高可能参与了脓毒症的发生发展。② KEGG 富集分析结果显示，靶基因显著富集于乳头瘤病毒感染、PI3K-Akt 信号通路、肌动蛋白骨架调节、MAPK 等主要信号通路。有研究表明，PI3K-Akt 信号通路与miR-125b-5p 可能存在一定的调控关系，同时SAKI 患者血清中VE-cadherin 水平高于对照组，可能因脓毒症导致血管内皮受损，血管内皮中VE-cadherin 释放进入血液循环，造成VEcadherin 在血清中水平升高，而血管内皮中的VEcadherin 水平下降［11］。相关性分析显示，miR-125b-5p 表达与血清中VE-cadherin 水平呈正相关，表明miR-125b-5p 可能参与了血管内皮中VE-cadherin表达调控。TargetScan 软件分析结果显示，VEcadherin 作为miR-125-5p 的靶向基因，miR-125-5p有可能下调血管内皮中VE-cadherin 的表达。

综上所述，miR-125b-5p 在脓毒症患者体内表达水平升高，可能抑制血管内皮细胞中VE-cadherin生成，导致其被降解为可溶性VE-cadherin 释放入血。因此miR-125b-5p、VE-cadherin 共同参与SAKI的发生发展，两者间的信号调节通路仍有待于进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突