浆细胞肿瘤多参数流式细胞免疫表型分析

白志瑶 堵艳 吴迪 代文芳 杨韵佳 陶景莉

作者单位：655000 云南曲靖，曲靖市第一人民医院检验中心

浆细胞肿瘤（plasma cell neoplasm，PCN）由终末期B 细胞（浆细胞或浆细胞样淋巴细胞）单克隆增殖导致，归巢于骨髓或骨髓外组织异常增殖并分泌同质性免疫球蛋白及片段（单克隆蛋白即M 蛋白）。较常见的有浆细胞骨髓瘤（plasma cell myeloma，PCM），也包括累及淋巴细胞与浆细胞的重链型PCN和华氏巨球蛋白血症（Waldenstrom macroglobulinemia，WM）及其他成熟B 细胞肿瘤［1］。

在实际临床工作中，由于部分骨髓瘤细胞在形态上与正常浆细胞大致相同，很难区分，而且随着浆细胞的成熟，B 细胞系特异性抗原及表面免疫球蛋白丢失，使骨髓瘤细胞表面抗原呈异质性。流式细胞术具有速度快、精度高、准确性好等优点。根据浆细胞表面抗原分子表达的不同，可将其分为正常浆细胞和恶性浆细胞。因此，在PCN 的临床诊断及科学研究中，对浆细胞表面抗原进行免疫表型分析具有广阔的应用前景，可作为PCN 的辅助诊断、预后评估及微小残留监测标志物，其价值已被越来越多的学者所认同。本研究旨在总结并分析常见PCN的流式细胞免疫表型特征，为临床辅助诊断浆细胞恶性肿瘤、监测病情和判断预后提供参考，现将结果报告如下。

1 资料和方法

1.1 研究对象 选择2014 年5 月—2020 年12 月在本院确诊的46 例PCN 患者作为研究对象。40 例多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者中男性23 例，女性17 例；3 例原发性浆细胞白血病（primary plasma cell leukemia，PPCL）患者中男性2 例，女性1 例；3 例WM 患者均为男性。所有确诊病例均符合国内诊断标准［2］。

1.2 主要仪器 贝克曼库尔特Navios 流式细胞分析系统购自美国Beckman 公司，生物安全柜购自美国Thermo 公司，高速离心机购自德国Sigma 公司。

1.3 研究方法 使用肝素抗凝管采集所有患者骨髓标本3 mL，根据实验号编写管号。两个样本管中分别加入所需抗体及100 μL 样本混匀，室温（20～25 ℃）避光染色15～30 min。加入2 mL FACS溶解液溶解红细胞15 min，振荡混匀，避光室温孵育至完全溶血。以1 700 r/min 离心5 min，弃上清混匀，加入1%小牛血清2 mL 洗涤，1 700 r/min 离心5 min，弃上清。2 号管加入打孔剂处理后，加入适量Kappa-FITC及Lambda-PE试剂孵育30 min。加入1%多聚甲醛固定液500 μL，等待上机检测。不立即检测的样本可暂时避光保存，在2 h 内完成检测。

1.4 伦理学 本研究经本院医学伦理委员会审批（审批号：2022YJKTY07），患者均签署知情同意书。

1.5 统计学方法 数据分析采用Excel 软件。计量资料符合正态分布以均数±标准差（±s）表示，计数资料以例（%）表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

流式细胞免疫分型结果 40 例MM 包括免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）型17 例，IgA 型9 例和轻链（light chain，LC）型14 例。3 例PPCL 包括IgG 型1 例和LC 型2 例。3 例WM 均为IgM 型。2.1 MM 患者免疫分型结果 40 例MM 患者中表达CD38 最多，为38 例，其次为CD138 表达29 例。见表1。

表1 40 例MM 患者流式细胞免疫分型结果

2.2 PPCL 患者免疫分型结果 3 例PPCL 患者均表达CD38，表达CD138、CD56、CD19 各1 例；3 例均为κ 轻链限制性表达。见表2。

表2 3 例PPCL 患者流式细胞免疫分型结果

2.3 WM 患者免疫分型结果 3 例WM 患者均表达CD38，2 例表达CD19，表达CD56、CD138 各1 例；3 例均不表达CD5、CD10、CD20 及CD22，2 例为κ 轻链限制性表达，1 例为λ 轻链限制性表达。见表3。

表3 3 例WM 患者流式细胞免疫分型结果

3 讨论

PCN 最常见的是MM，骨髓中异常的浆细胞数量是其主要诊断标准和疗效判断指标之一，但MM不同于其他血液系统恶性肿瘤。分化良好的骨髓瘤细胞在形态上与成熟浆细胞相似，形态学计数有一定困难，且MM 细胞呈灶性分布，易受穿刺部位、涂片水平和检验者经验等随机因素的影响，使得部分患者未能被及时诊断，错过了最佳的治疗时机，在临床实践中应该给予高度重视［3］。

目前，除浆细胞数量和形态可用于评判其克隆性外，免疫学表型是最常用的方法，浆细胞CD38 和CD138 阳性，CD19 阴性和（或）κ /λ 轻链限制性阳性为PCN 的重要特征［1］。有研究表明，正常浆细胞为多克隆，κ /λ 轻链比值约为1.5∶1，肿瘤性浆细胞为轻链限制性表达，欧洲骨髓瘤组织将κ /λ 轻链比值＞8（存在κ 轻链克隆）或＜0.2（存在λ 轻链克隆）作为出现单克隆异常浆细胞的标志［4］。通过增加获取的骨髓总细胞数可以检测出骨髓中＞0.01%的肿瘤浆细胞，直接评估骨髓肿瘤负荷。

本研究PCN 患者中，CD38 和CD138 是识别浆细胞的重要标志物。虽然CD34+造血祖细胞、自然杀伤细胞（nature killer cell，NK）、活化T 细胞以及单核细胞均可表达CD38，但正常浆细胞表面的CD38 分子表达水平明显高于其他类型的细胞，异常浆细胞表面CD38 表达往往减弱。CD138 分子为浆细胞分化抗原，出现于浆细胞祖细胞阶段，并随着浆细胞的分化成熟，其表达不断增强。正常骨髓中不表达CD138，仅浆细胞表达CD138，因此，CD138 是最具特异性的浆细胞标志物［5］。

CD45 是白细胞表面共同抗原，除血小板和红细胞以外，CD45 可在所有的造血细胞中表达。CD45在正常的未成熟阶段的浆细胞中高表达，而在浆细胞的分化和发育中，CD45 表达逐渐下调［6］。

CD56 是介导造血细胞黏附的分子之一，属于免疫球蛋白超家族成员，同时也是NK 细胞的表面抗原。CD56 一般不表达于正常成熟浆细胞表面，但可在神经外胚层来源的肿瘤细胞中检测到，并且CD56在MM 细胞中表达率较高，因此，常用于检测异常浆细胞，与不良预后有关［7-8］。本研究40 例MM 患者中，23 例表达CD56，2 例部分表达CD56；3 例PPCL 和WM 患者中均有1 例表达CD56。

CD27 属于肿瘤坏死因子家族成员，是成熟B 淋巴细胞向浆细胞转化的重要分子，表达于B 细胞和大部分外周T 细胞。此外，CD27 在正常浆细胞和意义未明单克隆丙种球蛋白血症（monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS）患者浆细胞表面均有表达，而在患者疾病进展期丢失，因此是临床判断MGUS 转归的指标［9］。本研究40 例MM 中，4 例表达CD27，3 例PPCL 和WM 均不表达CD27。林阳等［10］的研究报道提出，PCN 患者骨髓中常出现正常和异常浆细胞同时存在的情况，当正常浆细胞占骨髓总浆细胞比值≥5%时，有助于鉴别和诊断MGUS 与MM，并评估MGUS 向MM 转化的危险程度，同时识别良好型的MM。此外，约半数MM 细胞不表达CD27，在疾病进展期和复发期更明显［11-12］。

CD28 是T 细胞限制性抗原，在正常浆细胞中一般不表达，CD28 过表达时提示有疾病进展或复发情况发生［13］。本研究40 例MM 患者中，5 例表达CD28，3 例PPCL 和WM 患者均不表达CD28。CD19是相对分子质量为95 000 的糖蛋白，是B 细胞群的重要表面分子，与B 细胞活化及发育调节有关，有研究证实，CD19 在MM 细胞中很少表达甚至不表达，本研究40 例MM 患者中3 例表达CD19；3 例PPCL患者中1 例表达CD19；3 例WM 患者中2 例表达CD19。CD117 和CD34 分子为干组细胞标志物，在浆细胞表面不表达，本研究40 例MM 患者中2 例表达CD117。CD200 是一种跨膜糖蛋白，与CD200+骨髓瘤患者比较，有CD200-的骨髓瘤患者无事件生存期更长［14］。

浆细胞白血病（plasma cell leukemia，PCL）是一种罕见的浆细胞疾病，具有高度侵袭性，其特征是常规治疗反应率低，预后不良，且骨髓检查可见浆细胞恶性增殖，并可累及外周血［15-16］。PCL 的发病率极低，目前多为个案或少数病例的报道。本研究3 例PPCL 患者均表达CD38，且为胞内免疫球蛋白κ 轻链限制性表达，1 例表达CD138，1 例表达CD56，1 例部分表达CD19。林阳和万岁桂［10］报道PCL 细胞表型CD38、CD2、CD3、CD10、CD13、CD16、CD138、CD15 表达与MM 相似，PPCL 的CD28 表达率明显低于继发性PCL，CD28 有助于鉴别PPCL 与继发性PCL。因PCL 病例数较少，其免疫表型与MM 的差异还有待进一步观察积累。

WM 为惰性B 细胞非霍奇金淋巴瘤，约占非霍奇金淋巴瘤的1%～2%,指伴有IgM 分泌的淋巴浆细胞淋巴瘤（lymphoplasmacytic lymphoma，LPL），诊断时患者年龄为63～75 岁，男女比例约为2∶1［17］。本研究3 例WM 患者均表达CD38，2 例表达CD19，1 例表达CD56，1 例部分表达CD138，3 例均不表达CD5、CD10、CD20、cCD22，2 例为胞内免疫球蛋白κ轻链限制性表达，1 例为λ 轻链限制性表达。林阳和万岁桂［10］报道LPL 的肿瘤细胞具有与浆细胞相同的分化特征，单从形态上很难与PCN 区分，流式细胞免疫表型分析在LPL 与肿瘤细胞的鉴别诊断中有一定作用。

对PCN 流式细胞免疫表型进行分析时，合理的设门是提高检测敏感性和可重复性的关键。现有文献报道多以CD138/散射光和CD38/散射光设门。此外，值得关注的是，采用CD38/SSC 设门方法检测CD38 表达相对较弱的MM 细胞时易出现假阴性结果［10］。采用CD38/CD138 设门方法虽可提高浆细胞检出率，但因混有其他细胞的概率较高，易影响浆细胞异常免疫表型分析，而采用CD38/CD45设门方法虽可减少污染其他细胞的概率，但同时也容易遗漏大多数CD45+的恶性浆细胞。因此，采用CD38、CD138、CD45 及散射光特性联合分析，不但可提高异常浆细胞的检出率，同时也可以保证不同操作者之间检测结果的一致性。目前认为CD38++、CD138+、CD19+、CD56-、CD19-、CD56+是鉴别良性与恶性浆细胞的主要免疫表型［18-21］。因此，联合检测CD19/CD56与CD20、CD117、CD27、CD28、CD33，可提高恶性浆细胞的检出率。

综上所述，运用流式细胞术，对细胞进行免疫表型分析，可同时具备操作简便速度快，结果准确性和灵敏度高等优点，在PCN 的诊断及鉴别、预后判断、微小残留病（minimal residual disease，MRD）监测等方面具有极大的应用价值。

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