卵巢癌患者血清微小RNA 128的表达水平及与化疗效果和预后的相关性研究

李 品，刘春晖，石军荣，蔡智慧，侯 岩，李晶晶，齐 冀，闫丽伟

（河北大学附属医院 a.妇科；b.CT/MRI诊断，河北保定 071000）

卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，好发于围绝经期女性[1]，在女性生殖系统恶性肿瘤中，发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，病死率甚至高居榜首[2]，严重危害女性的身心健康。卵巢癌早期无明显症状，因此患者往往难以察觉，且病情进展迅速，以致超过60%的卵巢癌患者在确诊时已处于中后期甚至发生转移[3]。因此，早发现、早诊断、早治疗对于提高卵巢癌治愈率、改善患者生存质量具有重要意义。微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）是一类由19～25个核苷酸组成的非编码RNA，可在转录水平通过调控信使RNA参与多种细胞的生理与病理过程[4]。miR-128是一种在正常脑组织中高表达的miRNA，在神经系统的发育及正常生理活动中发挥着重要的作用[5]。研究发现miR-128在肝癌、胃癌等恶性肿瘤中异常表达，可参与肿瘤增殖、分化、侵袭、迁移以及凋亡等过程[6]，但卵巢癌患者血清miR-128表达情况及其对预后的评估价值尚未有文献报道，因此，本研究旨在探讨卵巢癌细胞中miR-128的表达水平以及对卵巢癌患者化疗效果和生存预后的影响，以期为卵巢癌临床治疗提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2012年6月～2017年12月在河北大学附属医院接受治疗的146例卵巢癌患者为观察组，年龄24～75（57.92±13.50）岁。纳入标准：①年满18周岁；②病理检查确诊卵巢癌；③研究所需资料完整。排除标准：①参加研究前曾接受过抗肿瘤治疗；②并发自身免疫疾病；③严重心、脑、肝、肾功能损伤；④不耐受化疗；⑤妊娠或哺乳期；⑥并发其他恶性肿瘤；⑦发生远处转移；⑧在治疗过程中放弃治疗或死亡。另选取同期参与本院健康体检的208例成年女性志愿者为对照组，年龄25～74（58.77±14.61）岁。本研究经河北大学附属医院伦理委员会审核并批准，所有研究对象均对本研究知情同意，并签字确认。

1.2 仪器与试剂 Trizol试剂盒（日本TaKaRa公司）；Nanodrop 2000分化光度计，逆转录试剂盒，qRT-PCR 试剂盒（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）仪。

1.3 方法

1.3.1 化学治疗方法：纳入卵巢癌患者均给予紫杉醇与卡铂药物联合治疗，其中紫杉醇135 mg/m2，静脉滴注，每3周1次；将300 mg卡铂加入500 ml浓度为0.9g/dl的NaCl注射液中，静脉滴注，每3周1次。3周为1个疗程，共治疗6个疗程。

1.3.2 标本采集及处理：所有患者均在治疗前和治疗后抽取4 ml空腹肘静脉血，室温下静置30 min后，高速离心10 min，提取上清液，放置在-80℃低温箱中保存备用。

1.3.3 血清miR-128表达的检测：提取总RNA，设计相关引物序列并合成引物，配制引物工作液；通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）逆转录合成cDNA，再进行荧光定量PCR，收集每次循环后的相关数据。以U6为内参，采用2-△△Ct计算miRNA-128的相对表达量，△△Ct=△CtmiR-128-△CtU6。引物序列：U6的上游引物为5’-GCTT CGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物为 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，引物长度为20 bp；miRNA-128的上游引物为 5’-TCCGATTTC TCTGGCCAG-3’，下游引物为 5’-GTGCAGGGTC CGAGGT-3’，引物长度为20 bp。通过受试者工作特征曲线（ROC）确定血清miR-128表达水平的最佳截断点，据此将患者分为miR-128低表达组和miR-128高表达组。

1.3.4 观察指标：收集观察组临床病理资料，包括肿瘤大小、是否淋巴转移、国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期情况、肿瘤分化程度、病理类型以及癌抗原125（cancer antigen 125，CA125）水平。

1.3.5 疗效评价：根据世界卫生组织（world health organization，WHO）实体瘤疗效评价标准[7]对卵巢癌患者治疗效果：完全缓解（complete relief，CR）：所有目标肿瘤均消失，且持续超过一个月；部分缓解（partial relief，PR）：基线肿瘤最大径之和减少至少30%，无其他病变，且持续超过一个月；稳定（stable disease，SD）：基线肿瘤最大径之和减少不到30%或增加不到20%，且持续超过一个月；进展（progressive disease，PD）：基线肿瘤最大径之和增加至少20%或出现新病灶；有效率=（CR+PR）/总例数×100%。

1.3.6 随访：患者化学治疗结束后每个月进行一次门诊随访，行妇科B超检查，记录患者的治疗效果及死亡情况。若随访到已死亡的患者，则通过患者家属或相关医务人员收集患者的死亡时间和死亡原因。所有研究对象的随访时间以死亡或满36个月为止。

1.4 统计学分析 应用SPSS 24.0统计学软件对所有数据进行分析，计数资料以例(%)表示，组间比较采用χ2检验；符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。采用二分类COX回归分析筛选患者化疗效果不良的预测因素，并用rms程序包建立列线图预测模型，采用校准曲线评价其预测效能；采用Kaplan Meier法绘制生存曲线，分析miR-128不同表达水平患者的生存情况，采用Log-Rank检验分析组间差异。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 观察组与对照组血清miR-128表达比较 观察组血清miR-128相对表达量（0.24±0.08）明显低于对照组（2.35±0.17），差异具有统计学意义（t=139.48，P＜0.001）。

2.2 观察组血清miR-128表达与临床病理特征的关系 见表1。两组间年龄、肿瘤大小和肿瘤组织类型差异均无统计学意义（均P＞0.05），淋巴转移、FIGO分期、分化程度和CA125水平的差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 miR-128表达与卵巢癌临床病理特征关系［n(%)］

2.3 不同miR-128表达水平的卵巢癌患者化疗效果比较 见表2。miR-128低表达组患者化疗后完全缓解和临床有效率明显低于miR-218高表达组患者，差异具有统计学意义（χ2=10.461，P＜0.05）。

表2 不同miR-128表达水平的卵巢癌患者化疗效果比较 [n(%)]

2.4 影响卵巢癌患者化疗效果的COX回归分析见表3。以卵巢癌患者治疗后是否有效为因变量，以临床病理特征和miR-128表达情况为自变量，进行单因素和多因素COX回归分析，结果显示，淋巴转移、FIGO分期III期以上、分化程度低、miR-128低表达和CA125≥200U/ml是卵巢癌患者化疗效果差的独立危险因素（P＜0.05）。

表3 卵巢癌患者化疗效果的Cox回归分析

2.5 构建预测卵巢癌患者化疗效果的列线图模型见图1。将多因素COX回归分析筛选出的独立预测因素作为预测因子构建预测卵巢癌治疗效果的列线图模型，结果显示，分化程度、淋巴转移、miR-128表达水平和FIGO分期对卵巢癌化疗效果的预测能力较强；CA125的预测能力较小。

图1 预测卵巢癌患者化疗效果的列线图模型

2.6 列线图模型的准确度评价 见图2。对本研究建立的列线图模型的校准度进行评价，校正结果显示，C-index为 0.826（95%CI：0.783～ 0.869），校准图中实际曲线与理想曲线拟合度较高，表明列线图模型对卵巢癌患者化疗效果的预测情况与实际观测情况较为相符。

图2 预测卵巢癌患者化疗效果的列线图模型校准图

2.7 miR 128不同表达水平患者的生存曲线 见图3。绘制miR-128不同表达水平患者的生存曲线，结果显示miR-128高表达组患者三年生存率为73.17%（30/41），中位生存时间为36（35.5，36）个月；miR-128低表达组患者三年生存率为44.76%（47/105），中位生存时间为 35（24.5，36）个月。miR-128高表达组患者的生存情况显著优于低表达组患者，差异具有统计学意义（Log-Rank χ2=9.548，P=0.002）。

图3 miR-128不同表达水平卵巢癌患者的生存曲线

3 讨论

卵巢癌起病隐匿，发病迅速，难以及时发现，且恶性程度高，预后效果较差[8]。近年来，尽管卵巢癌治疗手段已有长足发展，治疗效果也有明显改善，但是依然有超过50%的患者治疗后出现复发，且五年生存率并未出现明显提升[9]。因此研究与疾病转归及预后相关的敏感指标对于制定疾病治疗措施至关重要。miRNA是一类小的非编码RNA，能通过靶向调控mRNA的翻译功能来调控下游靶基因的转录水平[10]，已被证实可参与体内各种细胞的生理过程[11]。研究表明[12]miRNA的表达水平与卵巢癌的诊断和预后密切相关，可为提高卵巢癌的预后效果提供新的研究思路。

miR-128在神经系统中表达活跃，在人体神经发育过程中具有重要作用。已有研究证实[13]，miR-128在卵巢、子宫内膜、乳腺、前列腺、血液、淋巴、胃和肺等组织或器官中均有不同程度的表达，且在肿瘤组织和正常组织中的表达情况也不尽相同。本研究发现与卵巢癌患者相比，健康人群血清miRNA-128表达水平较高，表明miRNA-128对卵巢癌具有抑癌作用，且参与了卵巢癌发生和发展过程。miR-128与癌症相关的表达调控大体可以分为以下三个方面：①染色体中miR-128位点杂合子扩增或缺失使miR-128基因表达异常，如超过80%的原发乳腺癌患者肿瘤组织中miR-128表达下降，其原因是该RNA所在的染色体3p区域出现杂合性缺失[14]；②miR-128基因启动子区甲基化异常，如急性淋巴细胞白血病患者肿瘤组织中miR-128启动子区CpG岛甲基化程度显著降低，造成miR-128表达水平下降[15]；③miR-128加工过程发生异常，其宿主基因转录异常，降低其水平[5]。与上述研究结果一致，本研究的结果也认为miR-128是一种抑癌基因，并可能参与了卵巢癌发生和发展的过程。

本研究发现与miR-128高表达的卵巢癌患者相比，低表达组患者化学治疗效果和生存情况较差，且多因素COX回归分析结果显示，miR-128低表达是患者治疗效果差的独立危险因素，且与患者预后不良存在相关性。研究表明[16]，与对奥沙利铂药物敏感的结直肠癌细胞相比，耐药细胞中miR-128的表达水平更低；提高miR-128的表达水平，可降低耐药相关蛋白ABCC5和BMI-1的表达水平，进而使耐药细胞对药物重新敏感；抑制miR-128的表达，则会使SKOV3细胞获得耐药性。因此我们推测miR-128对卵巢癌治疗效果的影响可能与耐药性有关，miR-128低表达的卵巢癌患者易发生耐药现象，严重影响治疗效果和生存情况。

本研究还发现miR-128的表达程度、卵巢癌淋巴转移、FIGO分期、肿瘤分化程度是卵巢癌患者治疗效果不佳的独立危险因素，临床分期可反映肿瘤浸润深度及其对周围结构的侵犯范围，临床分期越高、淋巴结转移及分化程度越低，通常提示肿瘤的恶性程度越高，癌细胞增殖、侵袭和迁移能力越强，导致治疗效果不佳。且miR-128的表达程度与卵巢癌淋巴转移、FIGO分期、肿瘤分化程度密切相关，说明miR-128还可能是通过影响患者肿瘤发展、侵袭与转移等来影响患者治疗情况。研究表明miRNA的表达水平与卵巢癌发展进程和侵袭转移程度密切相关：miR-125a-5p可以抑制靶基因LIN28B的表达，进而抑制卵巢癌增殖、侵袭的能力[17]；miR-1224-5p则可以通过抑制SND1基因，抑制卵巢癌的增殖与侵袭[18]；miR-32可抑制卵巢癌恶性侵袭，其机制则是靶向调节BTLA基因的表达[19]；CHEN等[20]的研究结果表明，通过调节THBS1，miR-204-5p可促进卵巢肿瘤中的血管生成。然而目前为止miR-128影响卵巢癌患者癌细胞侵袭、转移的机制还不是很清楚，仍需扩大样本量进行深入研究。

综上所述，miR-128在卵巢癌患者血清中的相对表达量较低，是一种具有抑癌功能的miRNA，其低表达与卵巢癌的分化程度、FIGO分期、淋巴转移等密切相关，同时也是卵巢癌患者化学治疗效果不良和生存情况不佳的独立危险因素。然而miR-128参与调控卵巢癌发病和转移的机制还不清楚，需要进一步研究和探索。