肾癌组织YAP1/TAZ蛋白表达与临床病理特征及患者远期生存的相关性研究

高明珠，王进有，张 涛，邵 菲（安徽医科大学第二附属医院肿瘤科，合肥 230601）

肾癌是一种起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，据统计该病在所有成人恶性肿瘤中占比约为2%～3%[1]。由于早期肾癌患者临床症状表现不典型，超过1/3的患者在确诊时已发生转移，而发生转移的肾癌患者五年存活率仅约30%[2]，因此寻找能够影响肾癌患者远期生存率的相关因素具有重要意义。Hippo信号通路是一条磷酸化信号传导通路，在癌症的发生和发展中起重要作用[3]。Yes相关蛋白 1（Yes-associated protein 1，YAP1）和PDZ结合域的转录共刺激因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ）是位于Hippo信号通路下游的同源蛋白，具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用，研究[4-6]显示YAP1和TAZ蛋白在胃癌、肝癌、胰腺癌等癌组织中均高表达，且与癌症的进展有关。有研究[7-8]指出，对肾透明细胞癌细胞株上调YAP1表达可促进其增殖；破坏TAZ蛋白结构可在肾细胞癌中发挥肿瘤抑制基因的作用。据此推测YAP1和TAZ蛋白可能参与了肾癌的发生与进展。但肾癌组织YAP1和TAZ蛋白表达及其与临床病理特征及患者远期生存的关系尚未见相关报道。因此本研究选取132例肾癌患者探讨肾癌组织YAP1和TAZ蛋白表达与临床病理特征及患者远期生存的关系，以期加深对肾癌发生的分子机制的认识，为肾癌靶向治疗研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取安徽医科大学第二附属医院2016年1月～2018年10月收治的132例肾癌患者，其中男性93例，女性39例，年龄22～81（57.54±8.75）岁。肾癌细胞类型：透明细胞癌127例，乳头状细胞癌4例，集合管癌1例。临床分期[10]：I期17例，II期31例，III期52例，IV期32例；组织学分级[11]：I～II级95例，III～IV级37例。有副肿瘤综合征者30例，有远处转移者22例，伴下腔静脉癌栓者38例。纳入标准：①均符合肾癌诊断标准[9]，且经穿刺活检或病理学检查确诊；②均为初诊患者，既往无抗肿瘤治疗史。排除标准：①伴有其它恶性肿瘤患者；②伴有免疫系统疾病、血液系统疾病、内分泌疾病者；③伴有器质性疾病者；④伴有精神功能障碍者；⑤妊娠期或哺乳期妇女。剔除标准：①失访患者；②随访期间非肾癌原因死亡者，如交通事故、心脑血管病等。本研究受试者均签署知情同意书，且本研究已通过伦理委员会审批（审批号：201512-002）。

1.2 仪器与试剂 磷酸盐缓冲液（phosphate buff-ered saline，PBS），过氧化氢溶液（无锡市展望化工试剂有限公司）；鼠抗人YAP1，TAZ单克隆抗体和兔抗鼠YAP1，TAZ多克隆抗体（Abcam中国公司）；链霉卵白素工作液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；二氨基联苯胺显色液（上海尚宝生物科技有限公司）；苏木精染色液（西安齐岳生物科技有限公司）；二甲苯溶液（山东天乙化工有限公司）；RM2235型组织切片机（德国Leica公司）；CX53型光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 方法

1.3.1 治疗：符合手术指征者实施肾切除手术，不符合手术指征者实施保守治疗，其中手术指征[12]：临床分期为I～III期与IV期中原发灶潜在切除可能伴寡转移灶，原发灶潜在切除可能伴多发转移灶者，取此类患者手术后的癌组织和切缘正常组织；否则仅实施保守治疗，包括靶向治疗、放化疗等，此类患者均在开始保守治疗前进行穿刺活检取癌组织。将上述所取组织送至病理科待检。

1.3.2 YAP1，TAZ蛋白表达检测：采用免疫组织化学二步法检测。取手术组癌组织和切缘正常组织，取保守组穿刺活检组织，甲醛固定后石蜡包埋，切片（层厚4μm）。将石蜡切片经65℃烤制2h后脱蜡，磷酸盐缓冲液高温高压修复15min，过氧化氢溶液阻断过氧化物10min。再滴加一抗工作液在4℃条件下孵育过夜，再滴加二抗工作液、链霉卵白素工作液、二氨基联苯胺显色液，均孵育10min。苏木精复染，盐酸乙醇分化，稀氨水返蓝，二甲苯透明，中性树胶封固，以磷酸盐缓冲液为阴性对照。由二位病理医师采用双盲法阅片，随机选取5个视野，根据染色强度和着色比例进行综合评分[13]，染色强弱计分标准如下：无染色记为0分，弱染色记为1分，强染色记为2分；着色比例计分标准如下：≤10%记为0分，＞10%且≤25%记为1分，＞25%且≤50%记为2分，＞50%且≤75%记为3分，＞75%记为4分；将上述两者得分相乘，0～4分记为阴性，5～12分记为阳性。

1.3.3 随访：用门诊复查或电话沟通方式随访三年，将死亡患者记为死亡组（n=20），将生存患者记为生存组（n=108）。

1.4 统计学分析 将SPSS25.0软件作为统计学工具，计量数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立校本t检验；计数数据以“%”描述，用Pearsonχ2检验；Kaplan-Meier法分析肾癌患者三年内生存情况，采用Log-Rank检验生存差异；用COX回归模型分析肾癌患者三年内死亡的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织和切缘正常组织YAP1，TAZ蛋白阳性表达率比较 见图1，2。肾癌患者中共有3例失访，1例死于急性心肌梗死，均剔除本研究。手术组癌组织YAP1，TAZ蛋白阳性表达率分别为53.45%（31/58），48.28%（28/58），均高于切缘组织的22.41%（13/58），17.24%（10/58），差异有统计学意义（χ2=11.864，P=0.001；χ2=12.680，P=0.000）；穿刺活检癌组织YAP1，TAZ蛋白阳性表达率分别为77.14%（54/70），62.86%（44/70）。

图1 手术组免疫组化法YAP1蛋白表达（×200，刻度尺：50μm）

图2 手术组免疫组化法TAZ蛋白表达（×200，刻度尺：50μm）

2.2 不同临床病理特征肾癌患者癌组织YAP1，TAZ蛋白阳性表达率比较 见表1。不同临床分期、组织学分级、有无副肿瘤综合征、有无远处转移、是否伴下腔静脉癌栓患者的癌组织YAP1，TAZ蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），不同性别、年龄、病理类型患者YAP1，TAZ蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（均P＜0.05）。

表1 不同临床病理特征肾癌患者癌组织YAP1，TAZ蛋白阳性表达率比较[n=128，n（%）]

2.3 癌组织YAP1，TAZ蛋白表达的生存分析 见图3、图4。128例肾癌患者中三年内有20例死亡，三年内死亡率为15.63%（20/128）。癌组织YAP1蛋白阳性表达和阴性表达的肾癌患者三年内生存率分别为76.47%（65/85）和100.00%（43/43），差异有统计学意义（χ2=10.273，P=0.001）；癌组织TAZ蛋白阳性表达和阴性表达的肾癌患者三年内生存率分别为73.61%（53/72）和98.21%（55/56），差异有统计学意义（χ2=12.657，P=0.000）。

图3 YAP1蛋白不同表达肾癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

图4 TAZ蛋白不同表达肾癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

2.4 肾癌患者三年内死亡与生存患者的一般资料比较 见表2。三年内死亡组的临床分期III～IV期、组织学III～IV级、有副肿瘤综合征、有远处转移、伴下腔静脉癌栓、癌组织YAP1蛋白阳性表达、癌组织TAZ蛋白阳性表达占比均高于生存组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 三年内死亡组与生存组的一般资料比较 [n（%）]

2.5 肾癌患者三年内死亡的危险因素分析 见表3、表4。将三年内死亡或生存作为因变量，将临床分期、组织学分级、副肿瘤综合征、远处转移、伴下腔静脉癌栓、癌组织YAP1蛋白表达、癌组织TAZ蛋白表达作为自变量，分别纳入COX回归分析，结果显示临床分期III～IV期、组织学III～IV级、有副肿瘤综合征、有远处转移、伴下腔静脉癌栓、癌组织YAP1蛋白阳性表达、癌组织TAZ蛋白阳性表达均与三年内死亡有关（均P＜0.05）。将三年内死亡或生存作为因变量，将临床分期、组织学分级、副肿瘤综合征、远处转移、伴下腔静脉癌栓、癌组织YAP1蛋白表达、癌组织TAZ蛋白表达作为自变量，一并纳入COX回归分析，结果显示临床分期III～IV期、组织学III～IV级、有副肿瘤综合征、有远处转移、伴下腔静脉癌栓、癌组织YAP1蛋白阳性表达、癌组织TAZ蛋白阳性表达均是三年内死亡的危险因素（均P＜0.05）。

表3 赋值情况

表4 肾癌患者三年内死亡的COX回归分析

3 讨论

肾癌的发生是多因素共同作用的结果，可能与遗传、吸烟、肥胖、高血压及抗高血压治疗等有关[14-16]。目前已有报道[17-18]证实YAP1，TAZ蛋白高表达与肾癌的发生和进展有关，其或可用于肾癌远期生存的预测。既往关于蛋白表达对肾癌预后的预测作用鲜有报道。本研究主要从分子生物学角度分析与肾癌发生有关的蛋白YAP1和TAZ阳性表达与远期生存的关系，以期为肾癌患者远期生存的预测及靶向治疗的研究提供参考。

本研究结果显示肾癌患者三年内死亡率为15.63%，略低于徐明彬等[19]报道的19.05%，但远高于王强等[20]报道的5.2%，且患者的生存率远低于指南中报道的pT1a期五年生存率（90%以上）[21]，可能与所选样本量偏少、病情差异等有关。本研究结果与上述报道均提示积极探寻影响肾癌患者远期生存率的因素及其分子机制十分关键。本研究发现肾癌组织中YAP1，TAZ蛋白阳性表达率高于切缘正常组织，进一步分析显示临床分期、组织学分级、有副肿瘤综合征、有远处转移、伴下腔静脉癌栓均与肾癌组织YAP1，TAZ蛋白阳性表达有关，提示肾癌组织YAP1，TAZ蛋白表达与肾癌进展有关，可能通过参与淋巴结转移、肌层浸润、分化程度、远处转移影响预后。本研究还发现，癌组织YAP1，TAZ蛋白阳性表达均是肾癌患者三年内死亡的危险因素，提示癌组织YAP1，TAZ蛋白阳性表达可能预示着肾癌患者远期死亡风险高，可指导临床医师评价肾癌患者远期死亡风险，或可指导做出预后管理决策。

NGUYEN等[22]研究显示，YAP1，TAZ蛋白能够参与癌细胞的分化成熟过程，增强癌细胞的黏附和浸润能力，YAP1，TAZ蛋白阳性表达与肿瘤的临床分期、分化程度、发生淋巴结转移等均密切相关。另有研究显示YAP1和TAZ能够促进癌细胞的增殖、黏附及侵袭[23]。本研究结果与上述报道相符，再次印证了肾癌组织YAP1，TAZ蛋白阳性表达影响。本研究还显示，临床分期III～IV期、组织学分级III～IV级、有副肿瘤综合征、有远处转移、伴下腔静脉癌栓均是肾癌患者三年内死亡的危险因素，与既往相关报道一致[24-26]。此外有研究显示[27]，肾癌的组织学类型与患者的预后相关，本研究结果与上述报道不符，可能与患者的随访时间、抗肿瘤方案及依从性不同等有关。

但是本研究还存在一定不足：①受目前条件限制本研究所选病例数少，且受病例选取时间的限制本研究未对患者进行五年甚至十年的远期随访及分析，后续应扩大检测样本量，延长病例随访时间，探讨上述问题，为研发肾癌靶向生物制剂提供理论依据；②关于YAP1，TAZ蛋白高表达影响肾癌患者生存的具体分子机制尚不清楚，后续仍有待深入探讨。

综上所述，肾癌组织中YAP1，TAZ蛋白阳性表达率高于切缘正常组织，且YAP1，TAZ蛋白高表达与临床病理特征及远期生存有关。本研究的创新之处在于发现了YAP1，TAZ蛋白阳性表达与肾癌患者三年死亡率等均有关，可指导临床干预以降低肾癌患者的远期死亡率，同时也为肾癌靶向治疗的研究提供了新方向。