慢性盆腔炎模型大鼠中miR-29及炎症信号通路分子的表达水平及其作用机制研究

马慧敏，杨丽红，金瑞林，王娟娟（解放军陆军第81集团军医院妇产科，河北张家口 075000）

慢性盆腔炎是女性内生殖器及其周围结缔组织、盆腔腹膜的慢性炎症。常为急性盆腔炎未彻底治疗，或急性盆腔炎的病程迁延及反复发作，造成慢性盆腔炎[1-2]。微小核糖核酸（micro RNA，miR）在真核生物中表达具有组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，在细胞生长和机体发育过程的调节过程中起多种作用，并参与了炎症相关的多种疾病发生发展[3-4]。miR-29参与了胰岛素刺激的糖代谢并且是脂质氧化的重要调节因子，与人体生理和2型糖尿病有关，又可以作为一种肿瘤抑制因子抑制肿瘤的发生发展，在机体中发挥着多种重要生理调控功能，但miR-29在慢性盆腔炎中的作用研究较少并且机制尚有待解析[5-6]。本研究先用机械损伤及接种混合菌的方法构建大鼠慢性盆腔炎模型，并观察大鼠盆腔炎中miR-29表达的改变，再通过下调大鼠盆腔炎中miR-29表达，进一步观察慢性盆腔炎大鼠中炎症因子释放水平及Toll样受体4/核因子κB （TLR4/NF-κB）途径的变化，为miR-29在慢性盆腔炎的靶向治疗应用提供理论基础和分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源 80只8～10周龄雌性SPF级SD大鼠，220±20g, 由北京科兴生物制品有限公司提供[SYXK（京）2019-0053]。大鼠饲养于SPF级鼠房，室温调节在25±2℃，相对湿度40%～65%，12/12h昼夜交替照明，自由摄取食物和饮用水。适应性饲养一周后，随机分为四组，每组20只。

1.2 仪器与试剂 混合菌液（无锡赛维科技公司）；苏木精（H9627），伊红（861006）（美国sigma 公司）；Rat IL-6（interleukin-6） ELISA kit（H007），Rat IL-8 （interleukin-8）ELISA kit（H008），Rat IL-1β（interleukin-1β）（H002）ELISA kit 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所 ）；Rat TNF-α（tumor necrosis factor α）ELISA kit（RAB0479）（美国Sigma公司）；逆转录试剂盒（6110A）（日本Takara公司）；荧光定量PCR试剂盒（RT0411-01）（美国Biomiga公司）；引物由上海生工合成；Anti-TLR4（Toll like receptor） antibody (ab22048)，Anti-NF-kB（Nuclear factor activated B cells κ- Light chain reinforcement） p65 antibody (ab16502)，Anti-IKB alpha（Inhibitory Subunit of NF Kappa B Alpha）antibody (ab32518)，Anti-GAPDH antibody (ab9485)和二抗(ab150113)抗体（美国ABCAM公司）。MD pectraMax190酶标仪（美国）；-80℃超低温保存箱（美国 Thermo 公司），4℃冰箱（合肥美菱股份有限公司），SC-3610 低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），一次性使用微量采血管（泰州市宇杰医疗器械有限公司），DM-BA400-B显微镜（美国Motic 公司），Applied Biosystems 7500fastqPCR仪（美国Thermo公司），Western blot电泳仪（美国BIO-RAD公司），Multiskan SkyHigh全波长酶标仪（美国Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠慢性盆腔炎模型的建立：大鼠称重采用5g/dl戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。菌液配置：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型溶血型链球菌，按照1∶2∶1混合，用NaCl配制终浓度为2×109/ml菌液混合液。用水合氯醛麻醉大鼠后，将大鼠固定，无菌条件下腹部中央切1cm切口，固定并暴露大鼠双侧子宫，机械损伤子宫内膜组织，并分别向双侧子宫腔注入0.1ml混合菌液，建立慢性盆腔炎模型[7]，试验组造模后尾静脉注射5nmol miR-29 antagomiR，NC组尾静脉注射5nmol NC antagomiR，模型组和对照组注射等体积生理盐水，每3天1次，连续注射4次。建模后14天各组大鼠眼眶取血后，处死大鼠，取子宫进行实验，HE染色见大鼠子宫组织中淋巴细胞浸润并可见腺体增生，纤维结缔组织增生，提示造模成功。

1.3.2 大鼠子宫组织HE染色：对各组大鼠子宫进行固定包埋后切片，脱蜡覆水，苏木精染色5 min，5g/dl乙酸1 min，伊红染色1min，脱水：70g/dl，80g/1dl，90g/dl，100g/dl酒精各10s，二甲苯1 min，通风橱自然晾干再封片，于显微镜100×下进行拍照[8]。

1.3.3 采血方式及ELISA检测：毛细管眼眶采血，每只大鼠1ml，4℃ 3 000r/min 10 min分离血清后，严格按照ELISA试剂盒说明，分别加入到标记抗体（IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α）的酶标板中，37 ℃，30 min，加入底物液，每孔100 μl，置37℃避光放置5 min，加入终止液显色，每孔加入反应终止液50μl终止反应，于20min内测定实验结果，酶联检测仪测定吸光度（A）值，每组实验设置3个复孔[9]。

1.3.4 qPCR检测大鼠子宫组织mRNA的表达：大鼠子宫组织总mRNA采用Trizol法提取，miRNA逆转录和扩增使用cDNA Synthesis Kit试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix Kit，分别使用GAPDH和U6作为内参，所有操作在冰上进行并避免RNA酶污染。反转录进行qPCR，扩增条件：95 ℃ 预变性 10 min，95 ℃ 变性 10 s，60 ℃退火 30 s，72℃延伸 20 s，共40个循环。所有操作在冰上进行并避免RNA酶污染，以2－△△Ct计算miR-146a，TLR4，NF-κB和IκBα相对表达量，引物序列见表1[10]。

表1 引物序列

1.3.5 Western blot 检测大鼠子宫组织蛋白的表达：液氮研磨组织后提取子宫组织总蛋白后使用BCA法测定蛋白浓度。加入5×SDS的蛋白上样缓冲液煮沸后冻于-80℃备用。SDS-PAGE 电泳80v15min，120v 2h，PVDF膜转模120v 2.5h，TBST 漂洗3次，每次10min，使用5g/dl脱脂奶粉封闭，TBST漂洗3次，每次10min，加入TLR4，NF-κB，IκBα和GAPDH一抗、二抗室温孵育后，TBST漂洗3次，每次10min，ECL显色，发光仪曝光、拍照[11]。

1.4 统计学分析 采用 SPSS22.0软件进行统计学分析，实验独立重复三次，计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布并且满足方差齐性数据采用双尾独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性盆腔炎大鼠子宫动物模型构建 见图1。对照组子宫组织细胞整齐排列，各层无充血血管，炎症细胞无浸润，模型组和NC组组织结构不清晰，各层分界不明显，细胞变形，可见大量炎性细胞浸润，出现典型的慢性盆腔炎表征。试验组细胞排列较阴性对照组和模型组整齐，无充血血管，有少量炎症细胞浸润，分界相对明显，慢性盆腔炎表征有显著缓解。

图1 各组大鼠子宫组织HE染色比较（100×）

2.2 各组大鼠外周血的炎症因子水平变化 见表2。与对照组相比，模型组、NC组外周血IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α水平均显著升高，试验组稍增高，但差异无统计学意义。试验组外周血炎症因子 IL-1β，IL-6，IL-8和 TNF-α 水平较模型组、NC降低，差异具有统计学意义（F=23.021～35.947，均P＜0.01）。

表2 各组大鼠血浆炎症因子分析

2.3 各组大鼠子宫组织miR-29表达 对照组、模型组、NC组、试验组的大鼠子宫组织miR-29表达水平分别为0.76±0.026，1.68±0.031，1.72±0.024和0.41±0.014，与对照组相比，模型组和NC组子宫组织miR-29 水平上升，试验组子宫组织miR-29 表达稍有降低，差异无统计学意义。与模型组和NC组相比，试验组子宫组织miR-29 表达水平降低，差异具有统计学意义（t=5.015，7.678，均P＜0.01）。

2.4 各组大鼠子宫组织TLR4/NF-κB炎症通路表达 见表3、表4。qPCR及Westernblot结果表明与对照组相比，模型组和NC组炎症相关分子TLR4，F-κB和IκB α mRNA及蛋白表达水平升高；与模型组和NC组相比，试验组mRNA及蛋白表达水平降低，差异具有统计学意义（F=18.045～27.081，均P＜0.01）。

表3 各组大鼠子宫组织TLR4/NF-κB mRNA分析

表4 各组大鼠子宫组织TLR4/NF-κB蛋白分析

3 讨论

慢性盆腔炎是一种上生殖道感染，沙眼衣原体和淋病奈瑟菌是常见的病原体，未经治疗的盆腔炎可导致慢性盆腔疼痛、不孕、异位妊娠和腹腔内感染[12]。慢性盆腔炎性疾病在初潮前、无性生活和绝经后妇女很少发生，即使发生也多为邻近器官炎症的扩散，而在性活跃期、有月经的妇女中盆腔炎性疾病高发，慢性盆腔炎性疾病若未能得到及时、彻底治疗，可导致输卵管妊娠，炎性反复发作，甚至不孕，严重影响妇女的生殖健康，西医、中医等多种临床诊断疗法在中国已被广泛应用于慢性盆腔炎[13]的治疗。因此本研究拟探究慢性盆腔炎过程中子宫组织的损伤及病理变化，探究炎症因子及炎性细胞在此过程中发挥的作用。本研究通过机械损伤及接种混合菌成功构建大鼠慢性盆腔炎模型，发现造模后大鼠子宫形态异常，质地变硬，输卵管出现充血、增粗、阻塞或积水，盆腔脏器与周围结缔组织出现增生、黏连，由此提示造模成功。同时本研究发现在大鼠慢性盆腔炎过程中，子宫组织出现出血、黏连等恶性病变，腺体明显减少，子宫平滑肌纤维组织增生、黏连，上皮细胞变性、脱落、坏死，宫内膜缺失等现象，并伴有炎性细胞浸润，出现典型组织损伤，提示炎症损伤是慢性盆腔炎进展的重要因素，炎性细胞浸润和炎症因子的表达可能是子宫组织损伤的重要原因。

非编码RNA（non-coding RNA）是指不编码蛋白质的RNA，文献表明miR-29参与多种生物学过程，miR-29b能通过正向调节缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）的相对表达量来提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，从而促进细胞自噬，发挥对缺血损伤心肌细胞的保护作用[14]。同时miR-29可通过下调YY1和TGF-β途径蛋白改善骨骼肌萎缩和减轻肾纤维化[15]，也有研究发现HCC患者血浆中miR-29a含量和AFP浓度具有显著相关性，可能成为HCC诊断的参考指标[12]，由此可见miR-29可以在多种疾病中发挥关键的诊断作用，但miR-29在盆腔炎中的作用少有描述。因此本研究探究了miR-29在慢性盆腔炎发病过程中是否发生表达水平的改变。结果表明大鼠慢性盆腔炎过程中伴随着miR-29的高表达，通过下调miR-29的表达，发现miR-29可参与IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α等炎症因子的调控，这与当前研究表明的慢性盆腔炎患者外周血IL-6等炎症因子会显著增加，组织损伤加剧相一致[16]。因此我们推测miR-29具有参与炎症反应发生发展的作用，可以抑制多种炎症因子释放、降低炎性细胞浸润。

TLR4/NF-κB信号通路是免疫应答和炎症的关键调节通路[17]，研究表明TLR4/NF-κB信号传导改善LPS诱导的子宫内膜炎[18]。也有研究证实了盆腔炎患者TLR变异具有种族差异[19]，由此可见TLR4/NF-κB在盆腔炎等女性疾病中发挥着重要调控作用。本研究通过qPCR和Western blot分别检测了TLR4信号通路关键分子的mRNA和蛋白表达水平，结果表明，miR-29参与了TLR4，NF-κB和IκB α通路的调控，下调miR-29可以显著抑制TLR4，NF-κB和IκB α的表达。由此推测miR-29在慢性盆腔炎中的作用是通过TLR4/NF-κB信号通路的调控来实现的。

综上，本研究表明慢性盆腔炎模型大鼠子宫组织中miR-29发生显著表达，下调miR-29可以发挥抗炎症的作用及子宫保护的作用，此过程的机制与TLR4/NF-κB引发的炎症信号通路相关，本研究也具有一定的局限性，仅通过大鼠实验进行了分析，本研究可以进一步从人类组织样本中分析miR-29的表达水平及TLR4信号通路的表达情况，或通过GEO等数据库组学数据筛选miR-29的靶基因，并通过体外细胞实验和分子学验证miR的精准靶向基因，为miR-29对慢性盆腔炎的作用机制提供准确的通路互作关系。