急性脑梗死患者血清miR-130a水平表达与溶栓后再出血转化风险的预测模型及验证

杨 华，李致文，曹明善，殷海清，黄红革（邢台市第三医院 .检验科；.神经内科，河北邢台 054000）

急性脑梗死 (acute cerebral infarction，ACI)主要发病机制为脑部动脉血管粥样硬化导致血栓形成，造成脑部血流灌注不足，引起局部脑组织缺血、缺氧性坏死[1]。目前，临床上治疗急性脑梗死的首选静脉溶栓药物为阿替普酶（alteplase, rt-PA），通过将前体纤溶酶原转化为纤溶酶，从而溶解血凝块中的纤维蛋白，达到血管再通的效果，已被各国指南推荐[2-3]。但静脉溶栓治疗后容易发生出血转化，且大量研究报道显示出血转化是静脉溶栓治疗严重并发症，可延缓神经功能恢复，延长患者住院时间，具有较高的致残率以及病死率[4]，因此研究急性脑梗死患者溶栓后再出血转化风险的影响因素对于筛选高危人群及临床治疗具有重要意义。微小核糖核酸（micro RNA，miR）属于非编码单链RNA，具有高保守、内源性等特点，且可稳定存在于血清中，对于多种疾病具有良好的诊断以及预后评估价值[5]。近年来研究发现miR-130a可通过调控陷窝蛋白1(Caveolin-1)/基质金属蛋白酶2 (matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和9信号通路而破坏血脑屏障，加重脑出血后脑水肿，而血脑屏障严重受损是导致出血转化的关键原因[6]，因此推测认为miR-130a通过破坏急性脑梗死患者的血脑屏障而增加栓后再出血转化风险。目前，对于miR-130a预测急性脑梗死患者溶栓后再出血转化的价值尚未完全明确，基于此本文将通过实例探讨miR-130a的预测价值，同时通过建立列线图模型，以期指导医师针对高风险患者制定合理的溶栓治疗后防治方案，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 纳入2018年8月～2020年8月于邢台市第三医院诊治的175例急性脑梗死患者作为建模组，另纳入同期于邢台市第三医院诊治的100例急性脑梗死患者作为验证组，其中男性155例，女性120例，年龄50～76岁。患者均在知情同意书上签字，该研究方案已得到邢台市第三医院伦理委员会批准。

纳入标准：①符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》中脑梗死的诊断标准[7]；②头部MRI或CT检查结果均显示存在脑梗死，且出现明显的神经功能障碍（NIHSS>4分）；③患者发病症状持续时间≥30 min，且发病至静脉溶栓≤4.5 h；④年龄≥18周岁；⑤接受rt-PA静脉溶栓治疗。

排除标准：①心、肝、肾等重要脏器严重功能不全；②既往颅内出血或者脑卒中，活动性出血倾向；③近期颅内或椎管内手术，近三个月有重大头颅外伤；④疑蛛网膜下腔出血、急性脑出血、动静脉畸形、颅内肿瘤、动脉瘤；⑤其他药物(尿激酶等)溶栓，经动脉溶栓或血管内介入取栓治疗；⑥头部CT提示多脑叶梗死、颅内出血。

1.2 仪器与试剂 RNAiso™ Plus试剂盒（Abcam中国），miRNA逆转录试剂盒（Takara公司），台式高速离心机（Microfuge 20/20R，贝克曼库尔特公司），荧光定量PCR仪(Applied Biosystems AB；ABI Prisme Step-one型)。

1.3 方法

1.3.1 研究指标及随访：收集患者临床病历资料，主要包括性别、年龄、伴随疾病、血脂水平、分型、梗死面积、发病到溶栓时间、溶栓药物剂量等。所有患者参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》接受常规药物治疗[7]，治疗2周后接受头部 CT/MRI复查。

1.3.2 静脉溶栓治疗：所有入组的患者均在发病后4.5 h 内予以 rt-PA（厂家：德国勃林格英格翰公司；规格：50 mg/支或 20 mg/支）静脉溶栓治疗，使用剂量0.9 mg/kg，1 min内静脉推注总量的10%，剩余90%于1 h内静脉滴注，最大溶栓剂量≤90 mg。

1.3.3 出血转化诊断标准及分组：脑梗死出血转化是指急性脑梗死后缺血区的血管恢复血流灌注后而引起的出血[8]。目前，国内定义为脑梗死后首次头部CT/MRI未发现出血，而再次复查时发现有颅内出血转化。根据患者二周内复查是否出现出血转化分为发生组、未发生组。

1.3.4 血清miR-130a水平：患者入院后采集空腹外周肘静脉血4 ml，离心4 000r/min×10min，采用荧光实时定量聚合酶链式反应法检测。按照RNAiso™ Plus试剂盒步骤提取总RNA。采用miRNA逆转录试剂盒（Takara公司）逆转录miRNA，以U6为内参。miR-130a上游引物序列为5’-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3’；U6 上游引物序列为5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’,下游引物均为通用序列即5’-GTGCAGGGTCCGA GGT-3’。总反应体系为 5μl：1μl total RNA, 0.5μl Specific Stem-Loop RT Primer, 1μl 5×AMV Buffer,0.25 μl Reverse Transcriptase XL, 0.5μl dNTP Mixture, 1.75μl Nuclease-free H2O。PCR扩增条件：94 ℃预变性5min，94 ℃变性30s，60℃退火30s，共40个循环。采用荧光定量PCR仪(Applied Biosystems AB；ABI Prisme Step-one型)检测miR-130a的相对表达量，以2-△△Ct表示。

1.4 统计学分析 所有数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料以例数（百分数）的形式表示，统计分析采用χ2检验。正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，非正态分布资料以中位数(四分位数间距)[M(P25，P75)]表示，两组间比较采用独立样本Mann-WhitneyU检验。采用ROC曲线分析miR-130a预测出血转化的效能。单因素分析具有统计学意义的指标需纳入多因素Logistic 回归分析，明确经溶栓后再出血转化的独立危险因素。根据筛选的影响因素建立预测急性脑梗死患者溶栓后再出血转化的列线图模型，并进行模型验证。P＜0.05为差异有统计学意义。

列线图模型的建立：将Logistic 回归分析获取的危险因素引入R软件 (Microsoft open R 3.5.1），RMS程序包用于绘制列线图，将所有危险因素评分相加，所得总分对应概率即为列线图模型预测急性脑梗死患者溶栓后再出血转化的概率，得分越高表明风险越高。

列线图模型的验证：采用Bootstrap法对列线图模型进行内部验证（重复抽样1 000次）。用建立的列线图模型预测验证组的再入院风险，并对模型进行外部验证。采用Harrell’s Cstatistic计算一致性指数 (C-index)，并评估模型区分度。采用ROC曲线分析列线图模型对建模组、验证组患者的预测效能。

2 结果

2.1 急性脑梗死患者溶栓后再出血转化的单因素分析 见表1。共纳入接受溶栓治疗的急性脑梗死患者175例，其中再出血转化组（发生组）45例，未发生组130例，出血转化率为25.71%。两组患者心房颤动、美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute Health Stroke Scale, NIHSS)基线评分、溶栓药物剂量、溶栓前血糖、CT早期梗死面积、miR-130a比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），即发生组心房颤动发生率、基线NIHSS评分、溶栓前血糖、CT早期梗死面积处于较高水平、溶栓药物剂量，miR-130a处于较高水平。

表1 未发生组、发生组临床病例资料比较[n, ±s，M（P25，P75）]

表1 未发生组、发生组临床病例资料比较[n, ±s，M（P25，P75）]

项 目 发生组（n=45） 未发生组（n=130） χ2/t/z P性别 男 25 85 1.383 0.240女20 45年龄（岁） 62.68±4.08 61.26±4.52 1.599 0.112吸烟史 14 25 2.724 0.099高血压 28 66 1.764 0.184高血脂 25 61 0.997 0.318糖尿病 14 28 1.679 0.195心房颤动 24 32 12.670 ＜0.001基线NIHSS评分（分） 6（4,10） 4（2,6） 9.231 ＜0.001溶栓药物剂量（mg） 53.52(46.32, 61.38) 58.67(49.55, 85.24) 8.263 ＜0.001发病至溶栓时间（min） 201.32(134.00, 261.23) 194.00(132.50, 251.34) 1.658 0.102溶栓前血糖（mmol/L） 7.31(6.20, 9.18) 6.13(5.84, 7.38) 10.248 ＜0.001 CT 早期梗死面积 无 4 46 11.510 0.003＜1/3MCA 26 54≥1/3MCA 15 30高密度脂蛋白（mmol/L） 1.26±0.34 1.16±0.35 1.664 0.098低密度脂蛋白（mmol/L） 2.15±0.63 2.3±0.62 1.393 0.165总胆固醇（mmol/L） 5.27±0.92 5.46±1.04 1.087 0.279三酰甘油（mmol/L） 1.91±0.59 1.83±0.56 0.815 0.416 miR-130a 1.04±0.25 0.72±0.17 15.517 ＜0.001

2.2 急性脑梗死患者溶栓后再出血转化的logistic回归分析 见表2。以是否再出血转化作为因变量（是=1，否=2），将单因素分析结果中有意义的变量当作自变量（是=1，否=2）进行多因素 Logistic回归分析。结果显示：心房颤动、基线NIHSS评分、溶栓药物剂量、溶栓前血糖、CT早期梗死面积、miR-130a均是急性脑梗死患者溶栓后再出血转化的影响因素（均P＜0.05），其中溶栓药物剂量为保护因素，而心房颤动、基线NIHSS评分、溶栓前血糖，CT早期梗死面积，miR-130a为危险因素。

表2 出血转化的多因素 Logistic 回归分析

2.3 血清miR-130a预测再出血转化的价值 见图1。ROC曲线分析显示，血清miR-130a预测再出血转化的最佳截断值为1.08，曲线下面积为0.803（95%CI: 0.730～0.876）。

图1 血清miR-130a预测再出血转化的ROC曲线

2.4 列线图预测模型的建立 见表3，图2。应用R软件并基于心房颤动、基线NIHSS评分、溶栓药物剂量、溶栓前血糖、CT早期梗死面积，miR-130a建立预测再出血转化的列线图模型。结果显示心房颤动为21.15分；随着基线NIHSS评分、溶栓前血糖，CT早期梗死面积，miR-130a表达量的增加，溶栓药物剂量的降低，列线图模型相应评分增高，再出血转化风险升高。

图2 出血转化风险的列线图模型

表3 再出血转化的列线图模型评分

2.5 急性脑梗死患者溶栓后再出血转化的列线图模型的验证 见图3。对列线图预测模型进行内部、外部验证，列线图模型预测建模组与验证组的C-index分别为0.844和0.816。校准曲线显示该模型预测建模组与验证组再出血转化风险均具有良好的区分度、精准度。建模组的Cut-off值为115时，AUC 为 0.823(95%CI：0.753～ 0.894)，敏感度和特异度分别为88.89%，76.92%，验证组的Cut-off值为125时，AUC为0.797 (95%CI：0.722～0.872)，敏感度和特异度分别为81.82%，74.36%。

图3 模型组、验证组的ROC曲线

3 讨论

脑梗死出血转化是改善血流疗法（溶栓、抗血小板聚集、抗凝等）的常见并发症，发生于10%～40%急性脑梗死患者中[9]。本次研究共纳入接受溶栓治疗的急性脑梗死患者175例，其中发生再出血45例，出血转化率为25.71%，与既往研究结果相近。急性脑梗死患者出现出血转化，会增加脑梗死治疗方案选择的难度，因此早期预测出血转化发生风险对于筛选高危人群并指导急性脑梗死的精准治疗具有重要意义。近年来，预测急性脑梗死患者溶栓后再出血转化风险一直是临床研究的重点方向，尽管大量研究发现NIHSS评分、梗死面积等均可作为预后的独立危险因素，但各个指标对于出血转化的个体化预测价值并未进行明确论述，如何通过量化指标进行有效评估依然是医学难题[10-11]。近年来，越来越多研究报道列线图模型在预测临床事件风险中具有良好的应用价值，通过量化、可视化、图形化Logistic回归结果，实现个体化预测疾病风险。如杨赓等[12]通过建立列线图模型，可良好预测急性心力衰竭患者并发急性肾损伤风险，且区分度与精准度均较好，有助于指导医师筛选高风险患者，并调整防治策略，从而降低并发急性肾损伤风险。因此本文通过R软件建立列线图模型，并验证模型对于急性脑梗死患者溶栓后再出血转化风险。

本次研究通过单因素、多因素Logistic 回归分析显示溶栓药物剂量为急性脑梗死患者溶栓后再出血转化的保护因素，而心房颤动、NIHSS基线评分、溶栓前血糖，CT早期梗死面积和miR-130a为危险因素。分析认为，NIHSS基线评分用于评估脑梗死严重程度，评分越高则表明脑梗死引起的神经功能缺损越严重，预后越差。一项对rt-PA静脉治疗后出血转化危险因素的Meta分析结果发现，基线NIHSS评分≤4分组发生出血转化风险比例为0.9%，而基线NIHSS评分≥22分组的出血转化风险上升至6.8%[13]，结合本次研究结果表明随着基线NIHSS评分增加，则出血转化风险增高。血糖与溶栓后出血转化存在相关性，国外研究发现高血糖是溶栓后出血转化的预测指标之一，且高血糖可能抵消rt-PA溶栓治疗所带来的益处[14]，不利于疾病预后，故溶栓前需积极控制血糖[15]。大面积脑梗死是指大脑主干动脉闭塞导致较大面积的梗死，且研究表明头部CT或MRI显示梗死面积与出血转化的发生率呈正相关，其可能作用机制为大面积梗死灶内水肿脑组织压迫毛细血管，且随着rt-PA静脉溶栓治疗过程中侧支循环开放、脑水肿逐渐消退，使得被损害的毛细血管容易发生破裂，从而增加梗死灶周围出血转化发生风险[16]。脑出血时，miR-130a主要来源于凝血酶刺激下的脑微血管内皮细胞，可通过调控陷窝蛋白1介导的基质金属蛋白酶2和9的表达，从而増加血脑屏障通透性，加剧脑水肿。WANG 等[17]研究发现给大鼠侧脑室注射miR-130a抑制物后，可显著减轻脑出血后脑水肿，以及缓解血脑屏障的通透性，且升高的miR-130a和脑水肿程度密切相关，通过降低miR-130a水平，可减轻脑出血后脑水肿，表明miR-130a参与调控急性脑梗死患者溶栓后再出血转化。同时本次研究采用ROC曲线分析证实，血清miR-130a预测再出血转化具有较高的特异度和敏感度，表明血清miR-130a可作为预测出血转化的标志物。

本次研究应用R软件建立了预测急性脑梗死患者溶栓后再出血转化的列线图模型，比如某急性脑梗死患者心房颤动（得分=21.15分）、NIHSS基线评分为8分（得分=17.26分）、溶栓药物剂量60mg（得分=38.50分）、溶栓前血糖9mmol/L（得分=27.72分）、CT早期梗死面积1/3MAC（得分=15分）、miR-130a表达量为0.9（得分=18.3分），列线图模型评分总得分为137.93分，对应的出血转化风险为83%，表示该患者有83%的可能性发生出血转化，在临床诊治、护理干预过程中应该重点关注。同时，对建立的列线图模型进行内部、外部验证，结果表明模型的辨别能力较好。通过ROC曲线进一步分析显示该模型可有效预测急性脑梗死患者溶栓后再出血转化风险，具有临床应用价值。但由于本研究纳入病例数有限且属于单中心研究，统计分析可能存在一定程度的偏倚，可能具有一定的局限性，仍需进一步扩大样本量进一步证明。

综上所述，心房颤动、基线NIHSS评分、溶栓药物剂量、溶栓前血糖、CT早期梗死面积和miR-130a均是急性脑梗死患者溶栓后再出血转化的影响因素，且以这6项指标建立的列线图模型具有良好的再出血转化预测效能，以上指标可作为临床医师在评价急性脑梗死患者溶栓后再出血风险依据，提早进行预防处理，降低再出血转化率。