LncRNA UCA1介导Raf/MEK/ERK信号通路调控乳腺癌细胞生物学作用的机制研究

李 阳，包 刚(贵州医科大学附属医院乳腺外科，贵阳 550004 )

据GLOBOCAN 2020年发布的最新癌症统计，全球乳腺癌新发病例高达226万例，占女性新发癌症数的24.5%，其死亡病例达68万例，占女性癌症死亡总数的15.5%，远超女性其它癌症类型，严重影响女性患者的身心健康及生命危险[1-2]。目前乳腺癌的病因仍不清楚，可能与年龄、家族史、女性激素、生育和哺乳、外源性激素的使用及一些带有基因缺陷的遗传因素相关[3]。因此，探究影响乳腺癌发生发展潜在分子靶点，阐明其具体调控途径，是目前科研工作者研究的热点。长链非编码RNA（long non-coding RNA, LncRNA）是一种无蛋白编码功能的特殊RNA，参与调控肿瘤细胞增殖、侵袭、转移及凋亡等多种生物学进程，与肿瘤的发生发展密切相关[4]。LncRNA尿路上皮癌抗原1（urothelial carcinoma antigen 1，UCA1）属于人内源性逆转录病毒H家族的一员，具有原癌基因功能，可以调节细胞周期，控制细胞生长和分化，一旦被激活发生结构上的变化时，则会促使正常细胞癌变，促进癌症的发生发展[5]。有研究发现，LncRNA UCA1可促进肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞增殖、侵袭，为探讨肝癌发病机制提供了研究方向，在今后的肝癌研究中可作为潜在分子标志物[6]。另有研究表明，LncRNA UCA1在胃癌、肺癌、膀胱癌中都呈高表达，可以作为评判癌症发生与预后的独立危险因素[7-9]。目前有关LncRNA UCA1对乳腺癌的相关研究也有报道[10]，但其具体的作用机制尚不明确，需要更深入的探讨。因此，本研究着重分析LncRNA UCA1在乳腺癌细胞系中的表达及沉默LncRNA UCA1表达后对BT-474和MCF-7细胞的增殖、侵袭及凋亡等生物学作用的影响，进而深入探讨LncRNA UCA1在乳腺癌发生进程中的分子机制，为后期乳腺癌的临床治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 人乳腺上皮细胞MCF-10A，乳腺癌细胞BT-474，MCF-7，SKBR-3和MDA-MB453（武汉Procell生命科技有限公司），所有细胞均用含10 g/dl胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃ 5ml/dl CO2恒温孵育箱中进行常规培养。

1.2 仪器与试剂 胎牛血清，RPMI1640培养液（北京solarbio生物科技有限公司）；RNA提取盒、逆转录试剂盒（日本Takara公司）；CKK-8试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；Anti-RAF，Anti-MEK，Anti-ERK，Anti-p-MEK，Anti-p-ERK（德国Orgentec公司）；LipofectAMINE 2000 转染试剂盒（美国英杰生命技术有限公司）；Transwell 小室（北京优尼康生物科技有限公司）；流式细胞检测仪（美国贝克曼库尔特公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR检测各细胞系中LncRNA UCA1的表达：取常规培养的乳腺癌细胞，消化后接种于24孔板，待长至对数生长期后，提取各组细胞总RNA，并用紫外分光光度计检测其纯度，A260nm/A280nm为1.8～2.0即可；采用反转录试剂盒将单链RNA合成为双链cDNA，转录条件：65℃ 5 min（RNA变性），25℃ 5 min（退火），42℃ 30 min（反转录工作温度），85℃ 5 min（逆转录酶失活）；采用上述条件合成的双链cDNA进行RT-PCR扩增，扩增PCR条件：94℃ 5 min（预变性），94℃ 40 s（变性），40℃ 40 s（退火），72℃ 1 min（延伸），共35个循环，60℃延长10 min即可；最后以β-actin为内参，采用荧光定量PCR仪检测，相对表达量采用 2-ΔΔCt法计算。

1.3.2 细胞转染：取常规培养的BT-474和MCF-7细胞接种于6孔板，待融合度为80%左右时，更换为无血清培养液继续培养12 h，然后将两种细胞随机分为三组，即抑制转染（UCA1-siR）组、阴性转染（NC-siR）组及空白转染（control）组，所有操作按照LipofectAMINE 2000试剂盒说明进行，48 h后采用qRT-PCR法验证转染情况。

1.3.3 CKK-8检测BT-474和MCF-7细胞增殖能力：分别取UCA1-siR组、NC-siR组及control组对数生长期的BT-474和MCF-7细胞，消化后接种于96孔板中，置于37℃ 5ml/dl CO2孵育箱分别培养24，48，72和96 h，培养时间截止后每孔加入20 μl灭菌处理的CKK-8溶液，继续孵育4 h，弃去多余培养液，在波长450 nm处测吸光度值（A），吸光度值越大则表示细胞增殖能力越强。

1.3.4 Transwell实验检测BT-474和MCF-7细胞侵袭能力：分别取UCA1-siR组、NC-siR组及control组对数生长期的BT-474和MCF-7细胞进行消化，终止消化后弃去培养液，用PBS润洗1～2遍后，用无血清培养液重悬细胞，并调整细胞密度，将调整好的重悬液加入有Matrigel基质胶的Transwell上室，在下室加入600 μl 20g/dl FBS细胞培养液，注意小室与培养液之间不能有气泡，常规培养24 h，取出Transwell小室，弃去孔中的培养液，用PBS清洗3遍，乙醇固定30 min，适当风干后用0.1g/dl结晶紫染色20 min，用棉签擦拭上层未迁移的细胞，PBS清洗3遍，倒置晾干后置于显微镜下观察，随机选取5个高倍视野进行计数，细胞数多则代表侵袭能力强。

1.3.5 流式细胞仪检测BT-474和MCF-7细胞凋亡能力：分别取UCA1-siR组、NC-siR组及control组对数生长期的BT-474和MCF-7细胞，消化后2 000 r/min离心10 min，收集全部细胞，用冷PBS缓冲液洗涤2次，再用 1×Bingding Buffer缓冲液制成1×106/ml细胞悬液，取100 μl细胞悬液加入含有5 μl Annexin V-FITC工作液的Falcon管中，轻轻混匀，室温避光孵育15 min，用1×Bingding Buffer缓冲液洗涤细胞一次，弃上清，再加入5 μl PI染液，室温避光处放置10 min。各试管中分别加入 400 μl 1×Bingding Buffer缓冲液，1h 内上流式细胞检测仪测定。

1.3.6 Western blot检测BT-474和 MCF-7细胞中相关蛋白的表达：分别取各组对数生长期的BT-474和MCF-7细胞，弃去孔中培养液，消化后12 000 r/min离心10 min，收集全部细胞至1.5 ml离心管，用温的PBS冲洗3次，加入20 μl的loading buffe，混匀后沸水浴加热5 min，使蛋白充分变性，冷却至室温后可直接上样。提前配置好SDSPAGE分离胶和浓缩胶，待完全凝固后拔出梳子，用ddH2O冲洗胶孔，以去除残胶。加入蛋白样品，80 V浓缩，120 V分离，在电泳结束前20 min准备好转膜的所有器材，按顺序转好膜后放入转移槽，恒压110 V转移60 min，转膜完成后洗去膜上残留转膜液，用10g/dl脱脂奶粉室温封闭60 min，根据一抗说明书加入稀释好的一抗4℃孵育过夜，回收一抗，用PBST洗去残留一抗后加入HRP标记的二抗，室温孵育60 min，回收二抗，PBST漂洗3次后在暗室依次进行显影、定影，最后将胶片置于凝胶成像仪观察拍照，并用Image-J 软件分析各组蛋白相对表达。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；服从正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA UCA1在乳腺癌细胞系中的表达 与人乳腺上皮细胞MCF-10A相比，LncRNA UCA1在乳腺癌细胞系中呈高表达，BT-474，MCF-7，SKBR-3和MDA-MB453 mRNA表达水平分别上调了133.8%，169.2%，35.4%和73.8%，差异有统计学意义（F=34.152，P=0.002），因此，后续选择表达量较高的BT-474和MCF-7细胞作为研究对象。

2.2 细胞转染效果验证 qRT-PCR法验证发现，BT-474细胞control组、NC-siR组和UCA1-siR组LncRNA UCA1表达量分别为1.52±0.36，1.49±0.17和0.63±0.11，差异有统计学意义（F=42.628，P＜0.001）。MCF-7细胞control组、NC-siR组和UCA1-siR组LncRNA UCA1 表达量分别为1.75±0.25，1.70±0.22和0.74±0.08，差异亦有统计学意义（F= 39.372，P＜0.001），说明转染成功。

2.3 沉默 LncRNA UCA1表达对BT-474和MCF-7细胞增殖能力的影响 见表1和表2。CKK-8结果表明，与control组和NC-siR组相比，UCA1-siR组BT-474和MCF-7细胞增殖能力均显著下降，差异有统计学意义（F=57.382～198.251，P＜0.001）。

表1 不同时间点BT-474细胞吸光度值（A）比较（±s）

表1 不同时间点BT-474细胞吸光度值（A）比较（±s）

注：各时间点③组与①②组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。

时间 control组① NC-siR组② UCA1-siR组③ F P 24 h 0.219±0.013 0.205±0.020 0.090±0.006 70.350 ＜ 0.001 48 h 0.398±0.017 0.413±0.022 0.196±0.009 89.865 ＜ 0.001 72 h 0.764±0.025 0.742±0.018 0.418±0.013 107.982 ＜ 0.001 96 h 0.988±0.031 0.980±0.018 0.714±0.020 130.266 ＜ 0.001

表2 不同时间点MCF-7细胞吸光度值（A）比较（±s）

表2 不同时间点MCF-7细胞吸光度值（A）比较（±s）

注：各时间点③组与①②组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。

时间 control组① NC-siR组② UCA1-siR组③ F P 24 h 0.225±0.018 0.213±0.021 0.085±0.005 57.382 ＜ 0.001 48 h 0.437±0.015 0.428±0.023 0.207±0.012 92.560 ＜ 0.001 72 h 0.798±0.025 0.788±0.019 0.453±0.020 137.386 ＜ 0.001 96 h 1.008±0.027 0.995±0.031 0.748±0.024 198.251 ＜ 0.001

2.4 沉默 LncRNA UCA1表达对BT-474和MCF-7细胞侵袭能力的影响 Transwell结果显示，BT-474细胞control组、NC-siR组和UCA1-siR组穿膜数分别为205±12个，192±16个和114±9个，差异有统计学意义（F=108.250，P＜0.001）；MCF-7细胞control组、NC-siR组和UCA1-siR组穿膜数分别为187±9个，175±13个和96±12个，差异亦有统计学意义（F= 139.062，P＜0.001），提示沉默 LncRNA UCA1表达可以抑制乳腺癌细胞的侵袭。

2.5 沉默LncRNA UCA1表达对BT-474和MCF-7细胞凋亡能力的影响 见图1。流式细胞术检测结果显示，control组、NC-siR组和UCA1-siR组BT-474细胞凋亡率分别为4.25%，4.44%和10.28%，差异有统计学意义（F=49.134，P＜0.001）。control组、NC-siR组和UCA1-siR组MCF-7细胞凋亡率分别为2.30%，3.05%和8.98%，差异亦有统计学意义（F= 62.750，P＜0.001）。

图1 沉默LncRNA UCA1表达对BT-474和MCF-7细胞凋亡的影响

2.6 沉默 LncRNA UCA1表达对RAF/MEK/ERK蛋白表达的影响 见表3和表4。Western blot结果显示，与control组和NC-siR组相比，UCA1-siR组BT-474和MCF-7细胞中Raf，p-MEK/MEK及p-ERK1/2/ ERK1/2蛋白表达均显著下调，差异有统计学意义（F=42.384～76.092，均P＜0.001），说明沉默 LncRNA UCA1表达可以阻断乳腺癌细胞中Raf/MEK/ERK磷酸化途径。

表3 沉默LncRNA UCA1表达对BT-474细胞相关蛋白表达的影响（±s）

表3 沉默LncRNA UCA1表达对BT-474细胞相关蛋白表达的影响（±s）

注：各时间点③组与①②组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。

项 目 control组① NC-siR组② UCA1-siR组③ F P Raf 0.85±0.11 0.82±0.15 0.58±0.06 42.384 <0.001 p-MEK/MEK 1.12±0.23 1.08±0.20 0.72±0.13 76.092 <0.001 p-ERK1/2/ ERK1/2 0.98±0.19 0.95±0.22 0.64±0.10 49.506 <0.001

表4 沉默LncRNA UCA1表达对MCF-7细胞相关蛋白表达的影响（±s）

表4 沉默LncRNA UCA1表达对MCF-7细胞相关蛋白表达的影响（±s）

注：各时间点③组与①②组比较，P＜0.05，差异有统计学意义。

项 目 control组① NC-siR组② UCA1-siR组③ F P Raf 0.92±0.16 0.88±0.20 0.51±0.09 70.153 <0.001 p-MEK/MEK 1.08±0.21 1.05±0.18 0.68±0.15 61.258 <0.001 p-ERK1/2/ ERK1/2 1.02±0.15 0.98±0.22 0.60±0.08 57.084 0.152

3 讨论

随着医疗技术的不断进步，乳腺癌的治疗已经取得了巨大的进步，但由于乳腺癌早期症状不明显，容易被忽视而不能及时治疗，导致术后五年生存率较低，严重威胁患者的预后[11]。LncRNA UCA1作为具有调控作用的非编码RNA，参与多种生理和病理过程，在肿瘤细胞周期进程、信号转导和发育等过程中起关键作用[12]。WANG等[13]探讨了LncRNA UCA1对食管鳞状细胞癌生物学行为的影响，结果表明，LncRNA UCA1可以抑制EC109细胞增殖、迁移和侵袭，阻滞细胞周期进程，可能是一种参与食管鳞状细胞癌发展的新型生物标志物。LI等[14]探讨了LncRNA UCA1是否参与膀胱癌中的线粒体代谢及其具体的调控机制，结果表明，LncRNA UCA1在体外和体内通过UCA1/miR-195/ARL2轴增强线粒体功能和细胞活力，该信号通路为膀胱癌的分子病理学提供了更充分的理论基础，也为LncRNA UCA1作为膀胱癌的潜在诊治靶点提供了更充分的实验依据。ZHANG等[15]研究发现LncRNA UCA1在胰腺癌细胞中高表达，下调LncRNA UCA1表达则可抑制BxPC3中MMP2和MMP9的表达，显著降低胰腺癌细胞的侵袭和迁移能力，可能是一种更特异、更有效治疗胰腺癌的新策略。本研究发现，LncRNA UCA1在乳腺癌细胞系中表达水平显著升高，沉默LncRNA UCA1表达可以抑制BT-474和MCF-7细胞增殖和侵袭，促进其凋亡，对乳腺癌的发展起到了明显的抑制作用，与前期文献报道结果相吻合。

根据国内外文献报道，Raf/MEK/ERK通路已成为一条经典的肿瘤信号传导通路，该通路在多种癌症发生发展的过程中发挥重要作用[16-17]。薛华等[18]探索了miR-138-5p通过靶向赖氨酸甲基转移酶(SETD6)基因调控Raf/MEK/ERK通路抑制肝癌细胞迁移、侵袭的分子机制，结果发现，肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移受到miR-138-5p及SETD6的双重调控，miR-138-5p可能通过调节SETD6的表达调控Raf/MEK/ERK通路进而调节肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移，可为肝癌患者分子靶向治疗研究提供思路。LIANG等[19]探讨了人参皂甙Rg3通过靶向EGFR介导的Ras/Raf/MEK/ERK通路抑制肺癌细胞增殖，结果表明，Rg3可以通过EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK通路将细胞周期阻滞在G0/G1期，进而来抑制肺癌细胞的增殖。此外，还有研究发现了Ras/MEK/ERK通路在胰腺癌和造血系统癌症中的作用机制完全相反，WU等[20]研究表明Ras/MEK/ERK信号通路能诱导胰腺癌细胞凋亡，并对其增殖和侵袭产生抑制作用，这可能与p53蛋白的突变有关，因为通过MUT-p53/Ras和WT-p53/之间的双向调节可以抑制胰腺癌细胞周期发生阻滞；而在造血系统癌症中，针对Ras/Raf/MEK/ERK通路中信号元件的抑制剂，成为近来抗白血病治疗的新策略[21]。从上述文献可以看出，Raf/MEK/ERK信号途径在多种癌症的发生进程中发挥重要调控作用，但其对乳腺癌的生物学影响及作用机制还鲜有报道，故本研究着重探讨LncRNA UCA1介导Raf/MEK/ERK途径在乳腺癌中的调控作用，结果显示，抑制LncRNA UCA1可以下调细胞中Raf，p-MEK和p-ERK蛋白表达，阻断其磷酸化通路，进而诱导乳腺癌细胞凋亡，为后期乳腺癌的临床治疗提供了基础实验依据。

综上所述，LncRNA UCA1在乳腺癌细胞系中呈高表达，沉默LncRNA UCA1基因可以抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭，促进其凋亡，其作用机制可能与阻断Raf/MEK/ERK磷酸化通路有关。但本研究还有一定的不足之处，后续可通过动物模型和临床试验检测LncRNA UCA1在乳腺癌组织中的表达及调控机制，进而更深入地阐明乳腺癌的病理机制，为 LncRNA UCA1的临床应用提供更为可靠的实验依据。