苦荞不同部位酚类化合物组成与抗氧化活性

陈 月 朱 勇,2 秦礼康,2

(1. 贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州大学西南药食两用资源开发利用国家地方联合工程研究中心，贵州 贵阳 550025)

苦荞属双子叶蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrumesculentum)植物，学名鞑靼荞麦[1-2]。研究[3-7]表明，苦荞具有多种保健功能，其中内源酚类化合物是使其表现出这些保健功能的重要成分。课题组前期研究[8]发现，苦荞酚类化合物包括芦丁、槲皮素、没食子酸、绿原酸和2,3,4-三羟基苯甲酸，且芦丁是主要酚类化合物。Guo等[9]研究表明，苦荞中的芦丁、对羟基苯甲酸、咖啡酸和绿原酸主要分布在麸皮部位，原儿茶酸是苦荞壳中含量最丰富的酚酸，对羟基苯甲酸、原儿茶酸、没食子酸、咖啡酸和绿原酸等酚类物质少量存在于苦荞壳和苦荞粉中。刘琴等[10]研究表明，苦荞壳、麸皮和粉中共鉴定出8个多酚组分，其中芦丁为主要成分，在麸皮中的含量最高(2.6%～5.4%)，壳中次之(0.34%～1.75%)，粉中最低(0.15%～0.54%)。任顺成等[11]研究表明，苦荞壳和苦荞粉中也含有一定量的酚类化合物。Sinkovic等[12]研究了苦荞壳、苦荞麸皮和苦荞粉的生物化学组成、抗氧化活性和矿物质组成，但未对其酚类物质组成进行分析。

目前，苦荞加工主要集中在苦荞粉的制备及其综合利用，苦荞壳和苦荞麸皮的利用率较低。研究拟基于苦荞壳、苦荞麸皮和苦荞粉的酚类化合物组成与抗氧化活性，揭示苦荞酚类化合物及抗氧化活性在苦荞不同部位的分布规律，为苦荞精深加工与高值化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

苦荞：黔苦3号，贵州省威宁自治县农牧局；

没食子酸、福林酚、荧光素钠盐：美国Sigma-Aldrich公司；

芦丁、槲皮素、绿原酸、冰乙酸、2,2'-联氮双-(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二胺盐(ABTS)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

2,3,4-三羟基苯甲酸、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)：北京索莱宝科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：日本TCI公司；

2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(ABAP)：上海安耐吉化学有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪：1200 Infinity型，美国安捷伦公司；

光吸收酶标仪：SpectraMax190型，美谷分子仪器(上海)有限公司；

多功能酶标仪：M200 PRO型，瑞士Tecan公司；

台式高速冷冻离心机：H2-16KR型，湖南可成仪器设备有限公司；

旋转蒸发器：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂；

高速万能粉碎机：FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司；

恒温摇床：TS-100C型，上海天呈实验仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 苦荞研磨后过40目钢筛，筛上物为苦荞壳；筛下物再过60目钢筛后，筛上物为苦荞麸皮，筛下物为苦荞粉。

1.2.2 酚类化合物提取 根据文献[13-14]修改如下：1.0 g样品与15 mL 70%乙醇混合并振荡提取15 min，8 000 r/min离心5 min，收集上清液。剩余残渣继续提取2次，合并所有上清液，用70%乙醇定容至50 mL，每个样品做3次平行，此提取液用于总酚、总黄酮、HPLC以及抗氧化活性分析。

1.2.3 总酚测定 根据文献[15-16]修改如下：用去离子水配制一系列浓度的没食子酸标准品溶液，并将提取液稀释至适当倍数，100 μL提取液、100 μL没食子酸标准溶液分别与400 μL蒸馏水混合，向混合液中加入100 μL福林酚试剂，混匀并静置6 min，向其中加入1 mL 7% Na2CO3溶液和0.8 mL蒸馏水，室温避光反应1.5 h，测定760 nm处反应液的吸光度，以没食子酸标准液的浓度与吸光度绘制标准曲线。

1.2.4 总黄酮测定 根据文献[17]修改如下：用60%无水乙醇配制一系列浓度的芦丁标准品溶液，并将提取液稀释至适当倍数，0.5 mL提取液、0.5 mL芦丁标准溶液分别与2.25 mL蒸馏水和0.15 mL 5% NaNO2混合并反应6 min，加入0.3 mL 10% AlCl3·6H2O并反应5 min，加入1.0 mL 1 mol/L NaOH室温避光反应15 min后，测定510 nm处反应液的吸光度，以芦丁标准溶液的浓度与吸光度绘制标准曲线。

1.2.5 酚类化合物分析 根据文献[8]修改如下：提取液过0.45 μm滤膜，采用装有C18色谱柱(Agilent ZORBBAX 250 mm×4.6 mm，5 μm)的高效液相色谱仪，流动相包括乙腈(A)和1%冰乙酸(B)，洗脱程序：0～5 min， 5%～15% A；5～35 min，15%～35% A；35～40 min，35%～45% A；40～50 min，45%～5% A。流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL，检测波长360 nm。利用酚类化合物标准品保留时间对样品中未知化合物进行定性，以酚类化合物标准溶液浓度与峰面积绘制标准曲线。

1.2.6 氧自由基吸收能力(ORAC)测定 根据文献[18-19]修改如下：用磷酸缓冲液(75 mmol/L，pH 7.4)配制一系列浓度的标准品溶液，并将提取液稀释至适当倍数，取20 μL提取液和标准液于96孔黑板中，37 ℃孵育10 min，向每孔中加入200 μL荧光素钠盐溶液并再次孵育20 min，最后加入20 μL ABAP，并立即于激发波长485 nm，发射波长535 nm下检测反应液的荧光强度。每隔5 min记录一次，共记录35 次。以时间为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制荧光强度随时间变化曲线，通过标准品的浓度对曲线下净面积绘制标准曲线。

1.2.7 铁离子还原抗氧化能力(FRAP)测定 根据文献[20-21]修改如下：FRAP工作液由300 mmol/L醋酸缓冲液(pH 3.6)，10 mmol/L TPTZ溶液(溶于40 mmol/L HCl)和20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液按体积比10∶1∶1混合制备而成。用甲醇溶液配制一系列浓度的Trolox标准品溶液，并将样品稀释至适当倍数，取30 μL提取液和Trolox标准溶液，加入90 μL水和900 μL FRAP工作液，37 ℃下避光反应10 min，测定593 nm处反应液的吸光度，以Trolox标准品浓度与吸光度绘制标准曲线。

1.2.8 DPPH自由基清除能力测定 根据文献[17，22]修改如下：用甲醇配制一系列浓度的Trolox标准品溶液，并将提取液稀释至适当倍数，将100 μL提取液和Trolox标准溶液与4 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液混匀，室温下避光反应30 min，测定514 nm处反应液的吸光度，以Trolox标准品浓度与吸光度绘制标准曲线。

1.2.9 ABTS+自由基清除能力测定 根据文献[23-25]修改如下：将7.4 mmol/L ABTS+溶液和2.6 mmol/L过硫酸钾溶液按体积比1∶1混合，室温下避光反应12 h制得ABTS+储备液；用甲醇将ABTS+储备液稀释至适当倍数制得ABTS+工作液(734 nm处吸光度为1.10±0.02)。用甲醇配制一系列浓度的标准品溶液，并将提取液稀释至适当倍数，取300 μL提取液和Trolox标准溶液与6 mL ABTS+工作液混匀，室温下避光反应2 h，测定734 nm处反应液的吸光度，以Trolox标准品浓度与吸光度绘制标准曲线。

1.2.10 数据分析 所有数据均以平均数±标准偏差表示，n=3。利用Duncan多重比较进行数据之间的差异性分析(SPSS version 21.0)，显著性水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 苦荞壳、麸皮和粉的总酚、总黄酮含量

课题组[8]前期研究发现，苦荞中的总酚、黄酮含量分别高达(3 018.82±57.95) mg GAE/100 g·DW和(2 778.86±25.18) mg RE/100 g·DW。由表1可知，苦荞壳中总酚、总黄酮含量分别为(1 026±21) mg GAE/100 g·DW 和(1 555±60) mg RE/100 g·DW，占全苦荞的20.5%和19.9%。苦荞麸皮中总酚、总黄酮含量分别为(3 042±31) mg GAE/100 g·DW和(5 290±233) mg RE/100 g·DW，占全苦荞的60.8%和67.7%。苦荞粉中总酚、总黄酮含量分别为(931.1±16.9) mg GAE/100 g·DW 和(973.5±123.2) mg RE/100 g·DW，占全苦荞的18.6%和12.5%，说明麸皮是苦荞总酚、总黄酮的主要富集部位，也有少量存在于苦荞壳和苦荞粉中。刘琴等[10]研究表明，苦荞壳、麸皮和粉中总酚含量分别为29.87～60.93，44.03～79.83，1.18～10.67 mg/g，其中麸皮中的含量最高。Guo等[9]研究表明，苦荞粉、苦荞壳和苦荞麸皮游离酚、游离黄酮含量比结合酚、结合黄酮高，游离酚含量分别为苦荞粉<苦荞壳<苦荞麸皮，游离黄酮含量分别为苦荞粉<苦荞壳<苦荞麸皮，与试验结果一致。因此，苦荞麸皮含有更高的总酚、总黄酮，具有更好的健康益处。

2.2 苦荞壳、麸皮和粉的酚类化合物组成

苦荞壳、苦荞麸皮和苦荞粉中酚类化合物组成如表2所示，液相色谱图如图1所示。芦丁在苦荞麸皮中的含量为(5 152±61) mg/100 g·DW，占全苦荞的79.8%，苦荞壳和苦荞粉中芦丁含量分别占全苦荞的6.3%和13.9%。Guo等[9]研究发现，苦荞中的酚类物质主要来源于麸皮，麸皮中芦丁含量为(7 431.40±2.14) mg/100 g·DW。任顺成等[11]研究发现，苦荞麸皮中芦丁含量为36.37 mg/g，高于苦荞壳和苦荞粉中的，与试验结论一致。因此，芦丁是苦荞中的主要酚类化合物，这些酚类化合物主要富集在苦荞麸皮部位，但仍有部分存在于苦荞壳和苦荞粉中。

表1 苦荞壳、麸皮和粉的总酚、总黄酮含量†

表2 苦荞壳、麸皮和粉的酚类化合物组成†

1. 芦丁 2. 槲皮素图1 HPLC液相色谱图Figure 1 HPLC chromatogram

2.3 苦荞不同部位抗氧化活性

由表3可知，苦荞麸皮的抗氧化活性高于苦荞壳和苦荞粉，其ORAC、FRAP、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分别为(1 503.3±249.5) μmol/g·DW、(8 477.5±441.1) mg TE/100 g·DW、(5 642.4±241.3) mg TE/100 g·DW 和(16 764.0±742.0) mg TE/100 g·DW。苦荞麸皮ORAC、FRAP、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分别占全苦荞的67.7%，68.7%，65.9%，76.6%。结果表明，苦荞大部分抗氧化物质来源于麸皮部位。因此，食用全苦荞可能对健康有益，同时，苦荞麸皮具有作为功能性食品配料的潜力，可提高苦荞的附加值。苦荞麸皮总酚、总黄酮、酚类化合物和抗氧化活性最高，与前人[9]的研究一致，表明苦荞酚类物质主要集中在麸皮部位，这可能是因为苦荞麸皮中胚乳较少，含有种皮、糊粉层和胚组织(苦荞籽粒的大部分营养和功能成分集中在胚和糊粉层中)。因此，苦荞麸皮可以作为良好的功能食品原料。

表3 苦荞壳、麸皮和粉的抗氧化活性†

3 结论

试验表明，苦荞富含酚类化合物，这些酚类化合物主要富集在苦荞麸皮部位，其中芦丁是主要的酚类化合物。此外，苦荞麸皮表现出较强的抗氧化活性，其抗氧化能力占全苦荞的65.9%～76.6%。因此，苦荞麸皮是苦荞酚类化合物主要富集部位，在苦荞功能食品加工方面具有一定的应用潜能。后续可进一步对苦荞麸皮进行深加工并开展相关产品研究。