儿童狼疮性肾炎尿液生物标志物研究进展

王建敏 毛建华

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种具有多种临床症状的慢性自身免疫性疾病，涉及反复的慢性炎症和急性加重。狼疮性肾炎（lupus nephritis,LN）是SLE主要的也是最严重的临床表现之一。20%左右的SLE在18岁之前确诊，相较于成人SLE 40%～50%的LN发生率，儿童发生LN的概率高达80%，且常见于初次确诊的早期[1]，同时肾衰竭和死亡的风险也高于成人。肾活检的组织学证据不仅是诊断LN和确定肾小球、肾小管和间质病变程度的金标准，而且对治疗方案有指导作用。但肾活检是一项有创操作，有较大的并发症风险，尤其在儿童中，因此不适合反复多次进行。因此，临床上更加依赖侵入性较小的血液或尿液的相关指标来监测LN的活动情况及治疗效果。目前用于监测和评估LN的常规实验室指标，如24 h尿蛋白定量、尿蛋白/肌酐、ESR、肌酐清除率、抗双链DNA抗体和补体水平，对早期发现肾损害的灵敏度和特异度均较低。而LN的致病过程可能在肾功能受损和实验室指标检测到之前就开始了。对于LN的管理，越来越倾向于采用非侵入性生物标志物来实现。近年来，有前景的LN尿液生物标志物已经发现，可有效反映LN的活动性、复发倾向及对治疗的反应。

生物标志物是一种生物、生化或分子物质，可以通过实验室技术定性和定量地检测到，它与疾病的发病机制或在不同时间点的活动相关。因此，生物标志物可能具有诊断或监测价值，也可能预测患者对治疗或病程的反应[2]。对于LN来说，理想的标志物应当具有以下特点：（1）对SLE患者的肾脏受累有高度特异度；（2）能够建立与肾脏活动或损害的相关性；（3）可以纵向连续监测LN的疾病状态；（4）比常规临床或实验室参数更早地预测肾损伤，以便及时给予干预措施；（5）能够评估预后和治疗反应，以便临床医生能够识别哪些患者可能受益于更积极的治疗；（6）对于组织学分类和肾活检结果有提示意义[3-4]。在LN中，尿液越来越被认为是比血液更理想的发现生物标志物的媒介，因为尿液直接来源于肾脏组织，成分相对稳定。相比血液复杂的蛋白质数量及种类，尿液中仅含有2 000多种蛋白质，其中30%来自血液循环，70%来自泌尿系统本身。这些尿蛋白的改变反映了肾脏的生理和病理变化，所以更有可能产生LN肾脏特异性的生物标志物。LN的尿液生物标志物在儿童中若能提高早期诊断率、改善疾病监测和治疗反应评估的方法，对于儿童LN的管理及避免难治性儿童LN重复肾活检是非常有意义的。许多候选的尿液生物标志物，如趋化因子、细胞因子、生长因子和黏附分子等，已经被评估为LN潜在的生物标志物，在儿童中有所研究。本文就儿童LN尿液生物标志物的研究进展作一综述。

1 尿趋化因子

1.1 单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1） MCP-1是最早被描述的趋化因子之一，也是目前研究最广泛的尿液生物标志物之一，由肾脏中的系膜细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞和平滑肌细胞产生[5]，它主要通过与CC趋化因子受体2（CC chemokine receptors 2,CCR2）结合，在炎症和组织损伤中调节炎症细胞的运输和集聚[6]。MCP-1在肾脏疾病动物模型和肾脏患者中的作用已被研究和分析，在LN中主要促使炎症细胞浸润肾脏，进而导致肾脏炎症和组织损伤。大量儿童和成人的横断面及纵向研究表明，与对照组（非活跃LN和/或健康对照）相比，活跃LN患者的尿MCP-1水平升高。

在儿童LN的一项多中心纵向研究中，Watson等[7]检查尿MCP-1在64例儿童LN患儿中的水平，发现MCP-1是活动性肾病的独立预测因子，尿MCP-1水平是肾脏疾病随时间改善极好的预测因子。在一项观察性研究中发现尿MCP-1与蛋白尿呈正相关，与肾小球滤过呈负相关，不管疾病活动度和肾脏受累情况如何，SLE患者尿MCP-1水平都明显高于健康对照组[8]。MCP-1甚至会在肾脏复发及活动前2～4个月时显著升高。这对于早期确定儿童SLE的治疗方案和采取进一步措施预防肾损害有重要意义。最近一些研究表明尿MCP-1联合肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子（TWEAK）等与系统性红斑狼疮肾脏疾病活动指数（renal systemic lupus erythematosus disease activity index,rSLEDAI）及活检活性指数（biopsy activity index,BAI）相关性更好，并建议用于监测疾病活动和治疗反应[9-11]。所以建议在儿童LN中可常规检测尿MCP-1，用于监测肾脏的疾病活动和治疗反应，并且可以进一步研究基于抑制尿MCP-1表达的药物，从而为儿童LN的治疗开辟新的思路。

1.2 IFN-γ诱导蛋白 10（C-X-C motif chemokine 10,CXCL10） CXCL10是CXC趋化因子家族的一部分，该家族的趋化因子具有促炎特性，它是一个10 kDa的蛋白，被归类为Th1趋化因子，在IFN的刺激下，由浸润的单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞分泌，然后与受体CXCR3（主要在T淋巴细胞上表达）结合来调节免疫反应[12]。

研究发现，与非活动期SLE患者和健康对照组相比，活动期LN患者的尿液CXCL10显著升高，并且与SLE疾病活动度指数（systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI）和临床医师对疾病活动度的整体评估有良好的相关性[13]。一项横断面研究显示，尿CXCL10水平在LN患者中明显高于无LN的SLE患者，使用LN（有或无）和CXCL10（阴性或阳性，最佳截断值为0.93 pg/ml）作为二分类变量，CXCL10被发现是LN的高灵敏度（100%）和高特异度（98%）的有效预测因子，可以证实在LN患者中CXCL10与24 h尿蛋白、SLEDAI、肾活检分级等呈正相关[14]。然而在一项在儿童患儿中的研究发现，尿CXCL10在活动性LN、非LN患儿和对照组之间没有差异，这体现了成人LN和儿童LN的异质性[15]。

2 尿细胞因子

2.1 肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子（tumour necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK）TWEAK是TNF超家族配体中的一员，是一种多功能细胞因子，可与其受体成纤维细胞生长因子诱导14蛋白（fibroblast growth factor-inducible 14,Fn14）结合，介导多种生物活性，包括激活细胞生长、迁移或死亡，诱导血管炎和血管生成，以及促进成纤维反应。TWEAK在许多组织中普遍表达，在肾脏中，Fn14由肾固有细胞（包括足细胞、系膜细胞、肾小球内皮细胞和肾小管细胞）表达。正常情况下，Fn14在健康肾脏组织中普遍低表达或缺失，但在组织损伤、自身免疫及炎症时被迅速诱导，不受调控而过度激活，同时TWEAK水平相应升高[16]。在这种情况下，就可能会导致肾脏的进行性损伤和恶化。

因此，该细胞因子的尿液测定作为LN的生物标志物是非常有意义的。研究显示活动期LN患者的尿TWEAK水平明显高于没有或非活动期肾病和正常健康受试者[17]。当联合尿MCP-1时，在评价预后不良的肾损害时比其他参数（a1-微球蛋白、β2-微球蛋白、肌酐等）具有更好的鉴别能力，因此很适合作为一种筛查工具。在没有病理结果的情况下，以肾活检为中心，联合尿MCP-1和TWEAK，可快速鉴别严重LN患者，对肾损害进行更全面的评估[9]。鉴于TWEAK/Fn14的激活在LN发病机制中的重要作用，阻断TWEAK/Fn14轴对于LN的预后或许有很大改善。研究指出，Fn14敲除的雌性MRL/lpr小鼠的蛋白尿水平显著低于野生型雌性MRL/lpr小鼠，并且Fn14基因敲除小鼠的蛋白尿及肾组织病理学有显著改善，且伴有肾小球和小管间质炎症的减弱[18]。笔者认为随着更多大样本、多中心的研究深入，临床对于TWEAK在LN的作用会越来越清晰，抑制TWEAK/Fn14途径也会成为LN治疗的一个有吸引力的靶点。

2.2 骨保护素（osteoprotegerin,OPG） OPG是一种来自TNF受体超家族的可溶性蛋白，因其最具特征的作用是通过减少破骨细胞的生成来调节骨吸收，故而得名。人OPG基因位于染色体8q上，由5个外显子组成，已经发现OPG在肾脏中有表达，包括肾脏样本、培养的肾小管细胞和尿外泌体样囊泡[19]。

研究表明，尿OPG水平升高与rSLEDAI之间存在关联，当OPG同时与TWEAK、MCP-1和IL-8评估LN活动时，有更合理的灵敏度、特异度和预测价值[20]。另外在纵向研究中还发现，尽管尿OPG和血OPG在治疗随访中显著下降，但血OPG的下降趋势稳定性低于尿OPG，与抗双链DNA抗体、补体3、补体4和血OPG相比，尿液OPG在区分活动性LN患者方面有表现更好的AUC[21]。综上，尿OPG检测可能对预测LN治疗的不良反应和复发有价值，期待在儿童LN中有更多的研究，以进一步验证其价值。

2.3 转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β） TGF-β是一种具有广泛生理活性的二聚肽，在形态发生功能、免疫系统及组织重塑的调节和伤口的修复中发挥重要作用[22]。在炎症发生时，TGF-β主要在肾小球和肾间质中表达，刺激常驻间质细胞和募集血管周细胞向肌成纤维细胞的转变，以进一步刺激细胞外基质沉积，导致组织瘢痕化，最终导致慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）[23]。

在儿童患儿中，已观察到活动性LN患儿尿TGF-β水平显著升高，并与抗双链DNA滴度呈正相关。近期在一项对87例儿童和青壮年的LN患者（平均年龄15.6岁）连续研究中发现，对于治疗有反应的LN患者尿TGF-β显著低于无反应者[24]。另有研究发现无论是轻度LN还是严重LN，患者的尿TGF-β水平均高于正常对照组，提示尿TGF-β水平对LN有诊断意义，当联合尿中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）则有更高的灵敏度和特异度[25]。最近一项研究使用一种新颖的、定量平面蛋白微阵列技术对SLE患者的尿液进行了1 000个蛋白质的检测，发现尿TGF-β与疾病活动度高度相关，建议尿TGF-β可作为追踪LN疾病活动的潜在生物标志物[26]。无论如何，尿TGF-β在诊断LN和监测LN活动上都体现了其价值，期待更多大型的独立队列研究来证实其在儿童LN中的价值。

3 NGAL

NGAL是一种25 kDa的分子，最早在中性粒细胞中发现，在肾脏中呈结构性低表达，在炎症、缺血和感染等肾损伤时表达上调，NGAL已经在LN中被广泛研究。在一个独立的儿科队列研究[27]中，纳入了33例儿童SLE患儿（22例LN，11例非LN）与15例健康对照者，发现LN患儿尿NGAL水平高于非LN患儿及健康组，尿NGAL水平与rSLEDAI评分相关，并可预测Ⅲ型和Ⅳ型LN（灵敏度0.91，特异度0.70），提示尿NGAL是儿童增殖性（即Ⅲ型和Ⅳ型）LN的敏感标志物。当NGAL联合尿TGF-β时，其LN的诊断有较高的灵敏度和特异度[25]。另外一项多中心研究显示，尿NGAL在区分LN完全缓解、部分缓解和无缓解方面均优于血肌酐、尿蛋白、GFR等常规生物标志物[28]。更值得关注的是，研究显示尿NGAL水平在肾脏活动早期（3～6个月）就开始升高，这大大增加了NGAL作为LN早期生物标志物的可能性[29]。

4 血管细胞黏附分子

4.1 血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1） VCAM-1是一种90 kDa的糖蛋白细胞黏附分子，有助于调节炎症相关的血管黏附以及巨噬细胞、T细胞等白细胞的跨内皮转移。VCAM-1在正常儿童的肾小管上皮和肾小球内皮细胞中表达较差，但在增生性LN存在时表达增加，与疾病活动相关[30]。一项纳入了227例SLE患者的研究显示，80例活动性LN患者尿VCAM-1显著高于非LN患者和对照组，并且与SLEDAI评分、rSLEDAI评分以及尿蛋白/肌酐比值显著相关[31]。另一项研究显示尿VCAM-1/肌酐比值在活动性或低活动性LN患者中高于非活动性LN患者，当尿VCAM-1/肌酐比值基线为75百分位及以上的患者，在10年随访期间，肾小球滤过率恶化≥25%的风险增加了23倍，而包括抗双链DNA抗体在内的传统标志物无法预测这一结果[32]。因此，尿VCAM-1水平高可能表明患者长期肾功能丧失的风险增加。因此，该黏附分子的尿液测定对于LN的长期预后监测有很大意义。期待VCAM-1在儿童LN中有更深入的研究。

4.2 血管抑制素 血管抑制素为纤溶酶原N端片段，是一种抗肿瘤分子，通过减少内皮细胞增殖和中性粒细胞的激活和迁移，抑制炎症和血管生成[31-33]。尿血管抑制素水平在活动期SLE患者中升高，已被用于确定疾病活动度的一个指标，另外，血管抑制素水平也有助于区分LN活动的SLE患者和非LN活动的SLE患者，与传统的LN生物标志物相比，其有更高的特异度和灵敏度[31-33]。在一项研究中报道，高尿血管抑制素水平与SLEDAI、rSLEDAI和SLE国际合作临床损伤指数肾脏活动评分呈正相关，其特异度、灵敏度显著高于蛋白尿/肌酐比值[33]。在肾活检时分析发现，血管抑制素在正常组织中无表达，在Ⅱ级LN患者中低表达，在IV级LN患者水平最高。另一个发现是血清血管抑制素与任何疾病评分或尿血管抑制素水平无关，表明该分子具有肾脏局部生成的特性。一项近期的研究评估了尿血管抑制素、VCAM-1和CXCL4在SLE患者中的水平，发现与血清抗双链DNA及补体3相比，尿血管抑制素在鉴别活动性肾性SLE和活动性非肾性SLE时有更高的灵敏度、特异度[31]。综上，血管抑制素有可能作为SLE肾损伤的特异性标志物，需要进一步在儿童LN中研究以确定其效用。

5 其他尿液生物标志物

目前，全世界范围内都在积极寻找LN潜在的生物标志物[26,34-36]，如细胞因子IL-2、IL-23、IL-38[37]，蛋白质N-乙酰-b-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-b-D-glucosaminidase,NAG）、a1-抗胰凝乳蛋白酶[38]、肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）[29]、高迁移率族框1 蛋白（high-mobility group box 1 proteins,HMGB1）[39]、转铁蛋白及铜蓝蛋白[40]、触珠蛋白（haptoglobin,HAP）及α-1抗胰凝乳蛋白酶[41]、尿促血栓、抗血栓和纤溶分子[42]、尿mRNA[43]等均有研究。但是目前尚缺乏在大型队列研究数据。

6 小结和展望

几十年来，在LN中已经研究了大量的尿液生物标志物，并进行了大量的验证，而且有新的生物标志物不断被发现，但由于各项研究的异质性，包括评估方法、检测方法、使用工具的差异等，目前仍然没有一种生物标志物能很好地适应临床的需要。越来越明显的是，没有哪一种单独的生物标志物在评估LN的活动性及慢性程度或者预测LN的发生上能体现最佳的特异度和灵敏度，所以需要开发多种生物标志物来联合监测LN患者。已有一些这方面的努力，如狼疮肾脏活性指数（renal activity index for lupus,RAIL）项目[44]。目前的LN尿液生物标志物数据多是来自于成人队列，由于儿童LN更差的预后，更高的CKD发生率，所以比成人更迫切需要合适的生物标志物应用于临床，能够准确及时监测儿童LN的发生、发展及转归。目前LN生物标志物的发现及研究已经进入“组学时代”[36]，展望未来，重要的是在儿童和成人LN纵向合作研究中进一步验证已经确定的有希望的尿液生物标志物。对于LN的临床试验设计也应进一步改进和均质化，以便能够比较不同研究之间的结果，从而能够尽快将这些发现向临床转化。相信会有越来越多有前景的LN尿液生物标志物被发现，并能够与常用的血清和组织生物标志物结合，来指导儿童LN的治疗及管理。