SLM打印钛合金片表面含氟纳米二氧化钛薄膜结构的生物相容性及抗菌性能评价

吴楠 章晟 叶宸汐 袁振飞 林慧晶 游嘉 徐旭

种植牙技术已逐渐成为牙列缺损的主流修复方式之一。纯钛及钛合金是种植体最常用的金属，近年来，3D打印技术越来越多地运用于钛及钛合金种植体的加工制造[1-2]。选择性激光熔化技术（selective laser melting,SLM）是目前发展最为迅速的金属3D打印技术。SLM可以适应任意复杂结构的成型，可用于个性化设计种植体，使之与牙槽窝相匹配。已有体内外实验研究显示，在SLM打印钛合金种植体表面附着的成骨细胞表现出良好的黏附、增殖等生物性能，成骨相关基因显著表达，具有良好的骨结合能力[3-4]，证实SLM打印钛合金种植体具有良好的应用前景。但是，3D打印种植体表面粗糙度较高，细菌容易黏附并形成细菌生物膜，致使发生种植体周围炎[5]。而种植体周围炎一旦发生，即便采用现有的各种治疗措施，也难以达到令人满意的效果，最终可能导致种植失败。近年来，种植体表面改性逐渐受研究者们青睐，即对种植体表面进行功能化的纳米二氧化钛结构改性，引入氟使其具有稳定的表面抑菌效果[6]，这是提高种植体表面抗菌活性的同时提高骨结合能力的理想方法。氟已被证明具有良好的抗菌性能，较高的氟含量可以显著提高材料的抗菌性能、促进成骨，没有明显的细胞毒性[7-8]。成骨细胞在种植体表面的黏附和增殖是其表面生物相容性、生物活性优劣的重要体现。相较于单纯的纳米二氧化钛改性，掺杂氟的纳米二氧化钛结构可以促进成骨细胞在材料表面的黏附和增殖[7,9-12]。以往研究主要以传统切割纯钛或者钛合金片为研究对象，SLM打印钛合金片表面含氟纳米二氧化钛薄膜结构的生物相容性及抗菌性能评价研究少见。基于此，本实验对SLM打印钛合金片表面进行预处理获得含氟纳米二氧化钛薄膜结构，随后观察成骨细胞在其表面的黏附、增殖情况，以及该结构对其表面大肠杆菌、金黄色葡萄球菌生长的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞来源及主要试剂 小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1 Subclone 14细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司），细胞专用培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，型号：CM0378）；鬼笔环肽（北京索莱宝科技有限公司，型号：CA1620）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）溶液（北京索莱宝科技有限公司，型号：C0065）；抗荧光衰减封片剂（北京索莱宝科技有限公司，型号：S2100）；CCK-8试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，型号：CA1210）；4%多聚甲醛（上海源叶生物科技有限公司，型号：R20497）；Triton X-100（上海源叶生物科技有限公司，型号：S15022）；2.5%戊二醛（上海源叶生物科技有限公司，型号：R20510）；0.25%胰蛋白酶（上海源叶生物公科技有限公司，型号：R20107）；PBS（美国Gibco公司）；大肠杆菌（衢州市人民医院检验科，型号：ATCC25922）；金黄色葡萄球菌（衢州市人民医院检验科，型号：ATCC25923）；活/死细菌染色试剂盒（美国ThermoFisher公司，型号：L13152）；30%过氧化氢（上海凌峰化学试剂有限公司）；无水乙醇、异丙醇（国药集团化学试剂有限公司）；六氟钛酸（阿拉丁生化科技股份有限公司）；盐酸（永华化学科技有限公司）；超纯水（自制）。

1.2 主要仪器 荧光倒置显微镜（日本Nikon公司）；恒温水浴锅（美国ThermoFisher公司）；细胞培养箱（美国ThermoFisher公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；场发射扫描电子显微镜（日本日立公司，型号：SU8000）；恒温摇床（美国ThermoFisher公司）。

1.3 试样制备 选用SLM 3D打印钛合金片（直径10 mm，厚度1 mm，小圆片形）为基体。SLM 3D打印钛合金片由雷尼绍AM400打印制造（加工参数：功率200 W，点间距55 μm，曝光时间50 s）。将钛合金片经喷砂酸蚀等标准化处理去除表面部分熔化的粉末，用无水乙醇、超纯水各自超声清洗5 min，重复清洗3次后晾干。将其放入30 ml 30%过氧化氢的溶液里，置于80℃下1 h，然后将样品取出，用超纯水超声清洗，晾干备用。以六氟钛酸（0.885 mmol/L）、异丙醇（33 mmol/L）、盐酸（13 mmol/L）、过氧化氢（13 mmol/L）混合溶液为前驱液，将备用的钛合金片浸入盛有18 ml前驱液的25 ml规格聚四氟乙烯内衬不锈钢高压反应釜中，在160℃下水热反应2 h。反应结束后，取出样品并用超纯水超声清洗2 min，即实验组。未进行水热反应的样品为对照组。两组样品均置于超纯水中80℃过夜，晾干后，在120℃高压蒸汽灭菌30 min后备用。

1.4 试样的表征 制备的实验组钛合金片用扫描电子显微镜观察表面微形貌并使用X线能谱仪（energy dispersive spectrometer,EDS）定量分析表面元素。室温下，用光学接触角测量仪测量接触角，分析两组钛合金片的接触角，液体使用超纯水，每组选3个钛合金片，每个钛合金片表面测量3个位点。

1.5 成骨细胞活性实验

1.5.1 细胞培养 MC3T3-E1 Subclone 14细胞培养液为MC3T3-E1 Subclone 14细胞专用培养基。细胞置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，常规换液与传代。

1.5.2 DAPI和鬼笔环肽荧光染色 将钛合金片置于24孔培养板中，消化细胞后，铺于钛合金片表面，接种密度为2×104个/ml。分别培养3、6 h后，PBS轻柔漂洗2次，4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS漂洗3次，每次10 min。用0.5%Triton X-100溶液透化处理5 min，PBS漂洗3次，10 min/次。鬼笔环肽室温避光孵育30 min，PBS漂洗3次，5 min/次。用DAPI染色液复染细胞核，约3 min。吸除DAPI染色液，PBS漂洗3次，5 min/次。滴加适量抗荧光衰减封片剂，置于荧光倒置显微镜下观察成骨细胞黏附伸展的形态。实验均设置3组平行试验。

1.5.3 细胞形态学分析 将钛合金片置于24孔培养板中，消化细胞后，铺于钛合金片表面，接种密度为8 000个/ml。培养3 d后，PBS漂洗3次，2.5%戊二醛在4℃过夜。PBS漂洗3次，10 min/次，饿酸固定30 min，乙醇、叔丁醇梯度脱水：50%、70%、80%、90%依次脱水1次，10 min/次，100%脱水2次，10 min/次，临界点干燥和喷金后，用场发射扫描电子显微镜观察细胞在含氟纳米二氧化钛薄膜结构上的形态及突触分布，评估细胞生长分化情况。实验均设置3组平行试验。

1.5.4 细胞黏附实验 将钛合金片置于24孔培养板中，消化细胞后铺于钛合金片表面，接种密度为2×104个/ml。培养30、60和120 min后，用PBS冲洗3遍后至新的培养板中，每孔加入50 μl的CCK-8溶液，再加入500 μl的新鲜培养基，置于37℃培养箱中培养2 h，吸取100 μl反应液放入96孔板中，利用酶标仪在450 nm波长条件下检测其吸光度A值。实验均设置3组平行试验。

1.5.5 细胞增殖实验 将钛合金片置于24孔培养板中，消化细胞后铺于钛合金片表面，接种密度为8 000个/ml。培养1、3和7 d后，用PBS冲洗3遍后至新的培养板中，每孔加入50 μl的CCK-8溶液，再加入500 μl的新鲜培养基，置于37℃培养箱中培养2 h，吸取100 μl反应液放入96孔板中，利用酶标仪在450 nm波长条件下检测其吸光度A值。实验均设置3组平行试验。

1.6 抗菌性能实验

1.6.1 菌种活化 将冷冻保存的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌从超低温冰箱中取出，快速恢复到室温。在超净工作台内使用75%酒精棉球擦拭细菌冻存管表面，随后将菌液倒入无菌琼脂固体培养基中，放入37℃恒温培养箱中复苏24 h，用无菌的细菌接种环蘸取上述复苏所得菌液在无菌琼脂固体培养皿上按Z字形划线，继续将接种好的培养皿放入37℃培养箱中培养12 h，可观察到单个菌落形成，用封口膜密封后倒置放于4℃冰箱保存备用。

1.6.2 菌液制备 用灭菌接种环挑取形态正常的单菌落置于相应液体培养基中，并放入恒温摇床中，37℃，200 r/min摇菌过夜；以12 000 r/min离心过夜菌液5 min，小心弃上清液，用PBS缓冲液重悬细菌。利用酶标仪检测菌液在600 nm处的吸光度A值，根据测得的A值估算菌液浓度，并用培养基稀释数倍，将最终浓度调整为1×106CFU/ml（A600nm为1时，菌液浓度大概为1×109CFU/ml，以此按倍数稀释）备用。

1.6.3 平板活菌计数实验 将钛合金片在紫外灯下灭菌24 h，分别取1 ml浓度为1×106CFU/ml的两种菌液于24孔板，将钛合金片用无菌镊子加至24孔板，使其低于菌液液面，置于37℃恒温培养箱中震荡培养4 h，取出钛合金片用无菌PBS冲洗掉表面浮菌。然后，将各组钛合金片加入到含有5 ml无菌PBS的离心管中。涡旋振荡仪震荡5 min，使钛合金片表面的细菌脱落到PBS溶液中，稀释相同倍数后，各取10 μl菌悬液均匀涂布在琼脂固体培养基平板上，在37℃条件下培养24 h，拍照记录菌落数量，计算各组材料表面抑菌率。实验均设置3组平行试验。抑菌率由下述公式进行计算。抑菌率（%）=（对照组菌落数-实验组菌落数）/对照组菌落数×100%。

1.6.4 活/死细菌染色实验 将钛合金片在紫外灯下灭菌24 h。分别取1 ml浓度为1×106CFU/ml的两种菌悬液于24孔板中，将钛合金片用无菌镊子加至24孔板，使其低于菌悬液液面，置于37℃恒温培养箱中震荡培养4 h，无菌PBS冲洗掉表面浮菌。根据活/死细菌染色试剂盒操作说明书，在材料表面滴加SYTO 9绿色荧光核酸染料和碘化丙啶（propidium iodide,PI），避光孵育15 min，无菌水冲洗2次。然后制样，在荧光倒置显微镜下观察。实验均设置3组平行试验。

1.7 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组钛合金片的表征结果比较 扫描电镜结果显示，经酸蚀、水热处理后的实验组钛合金片表面有纳米二氧化钛薄膜结构形成，见图1。实验组钛合金片表面EDS能谱元素分析结果显示，经过水热处理后该层二氧化钛薄膜含有氟元素，见表1。对照组钛合金片表面接触角为（94.8±7.4）°，实验组表面接触角为（30.6±9.1）°，这可能与实验组钛合金片表面纳米薄膜片状结构有关，增加了钛合金片表面的比表面积和浸入空间。实验组钛合金片接触角低于对照组，两组之间差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。而接触角的大小与材料表面的亲水性成反比，因此含氟纳米二氧化钛薄膜结构的SLM打印钛合金片亲水性显著高于无表面处理的钛合金片。

图1 实验组钛合金片表面扫描电镜观察所见（×100 000）

表1 实验组钛合金表面EDS能谱元素分析

图2 实验组与对照组钛合金片表面接触角比较

2.2 成骨细胞活性实验结果

2.2.1 DAPI和FITC phalloidin荧光染色后的两组细胞黏附伸展形态比较 细胞荧光染色照片显示，培养3 h后，在对照组钛合金表面，细胞数量少，肌动蛋白未见明显拉长，见图3a（插页）；在实验组钛合金表面，细胞数量较多，细胞铺展面增加，肌动蛋白开始拉长，见图3b（插页）。培养6 h后，在对照组钛合金表面，细胞数量增加，肌动蛋白更加清晰，见图3c（插页）；在实验组钛合金表面，细胞数量较多，细胞铺展面增加，部分细胞成长梭形，肌动蛋白更加伸展，呈指状突起，肌动蛋白纤维开始清晰，见图3d（插页）。

图3 荧光倒置显微镜观察两组细胞荧光染色后的黏附伸展形态（a：对照组培养3 h后；b：实验组培养3 h后；c：对照组培养6 h后；d：实验组培养6 h后；×400）

2.2.2 两组钛合金片表面细胞形态学比较 扫描电镜下观察MC3T3-E1 Subclone 14细胞的黏附形态，培养3 d后，对照组细胞数量较少，伸展较差，细胞呈短梭形，伪足圆钝且短，触角较少；实验组细胞数量较多，伸展较好，细胞呈长梭形，伪足细长，触角较多，见图4。

图4 扫描电镜观察两组钛合金片表面细胞黏附伸展情况

2.2.3 两组钛合金片表面细胞黏附能力比较 细胞在钛合金片表面培养30、60、120 min后，实验组细胞黏附能力均高于对照组（均P＜0.05），见图5。

图5 两组钛合金片表面细胞黏附能力比较

2.2.4 两组钛合金片表面细胞增殖能力比较 培养3、7 d后，实验组细胞增殖能力高于对照组（P＜0.05），培养1 d时两组细胞增殖能力比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图6。

图6 两组钛合金片表面细胞增殖能力比较

2.3 抗菌性能实验结果

2.3.1 两组钛合金片对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌生长的影响比较 平板活菌计数实验结果显示，与对照组钛合金片共培养4 h后的细菌在琼脂固体培养基平板上生长旺盛，而与实验组钛合金片共培养可明显抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。经过细菌计数发现，实验组钛合金片对大肠杆菌抑菌率达61.20%，对金黄色葡萄球菌抑菌率达69.05%。实验组大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌落数均低于对照组（均P＜0.05），见图7（插页）、表2。

图7 两组平板活菌计数实验结果图

表2 两组钛合金片表面细菌培养4 h后平板活菌计数比较（个）

2.3.2 两组钛合金片抗菌性能比较 利用活/死菌染色实验进一步评价两组钛合金片表面的抗菌性能，SYTO 9能穿透活细菌和死细菌的细胞膜，显现出绿色荧光，而PI只能穿透死细菌的细胞膜，显现出红色荧光。结果显示，对照组钛合金片表面有较多的绿色荧光，而在培养相同时间的实验组钛合金片表面有较多的红色荧光，且金黄色葡萄球菌组差异较大肠杆菌组明显，见图8（插页）。

图8 荧光倒置显微镜观察两组钛合金片活死菌染色后的情况（×100）

3 讨论

良好的骨结合形成是种植牙成功的基础[13]。种植体周围骨结合的形成是一个多步骤的过程，它包括了成骨细胞在种植体材料表面的黏附、增殖、分化。其中成骨细胞的黏附既是种植体材料表面与成骨细胞反应的第一步，又是骨结合形成的首要环节，因此成骨细胞在材料表面的早期黏附是评价其生物相容性和生物活性的一个重要指标[14]。细胞的黏附与材料表面的亲水性有密切关系，而亲水性可以通过测量材料表面的与液体之间的接触角来计算，材料与水之间的低接触角表明水在材料表面的扩散良好，说明材料具有高亲水性[15]。目前大部分学者认为成骨细胞更容易黏附在高亲水性的材料表面。Toffoli等[16]认为热处理改善了钛表面成骨细胞的黏附的原因是热处理提高了钛表面的亲水性，从而提高了纤维连接蛋白的黏附。

本实验通过接触角测量来评价具有含氟纳米二氧化钛薄膜结构的SLM打印钛合金片与无表面处理的钛合金片的亲水性，再通过荧光染色、扫描电镜观察、细胞黏附实验和细胞增殖实验来评价成骨细胞在材料表面的黏附、增殖水平。

扫描电镜观察证实，前驱液浸泡和水热法表面处理在钛合金片表面成功制备了纳米二氧化钛薄膜结构。EDS能谱元素分析结构显示，经过水热处理后该层二氧化钛薄膜含有氟元素。接触角测量结果进一步提示，含氟纳米二氧化钛薄膜结构可以提高钛合金片表面的亲水性，与以往研究结果一致[17]，这可能与纳米薄膜片状结构增加了钛合金片表面的比表面积和浸入空间有关。细胞黏附实验结果显示，在体外培养30、60、120 min后，成骨细胞在含氟纳米二氧化钛薄膜结构的钛合金片表面的黏附均显著高于无表面处理的钛合金片表面。一方面，可能是因为含氟纳米二氧化钛薄膜结构的SLM打印钛合金片具有较高的亲水性。亲水性的提高可以促进成骨细胞在钛合金片表面的早期黏附[18]，与无表面处理的钛合金片相比，含氟纳米二氧化钛薄膜结构的SLM打印钛合金片具有更小的接触角，即更好的亲水性。另一方面，含氟纳米二氧化钛薄膜结构可能使得实验组钛合金片比无表面处理的钛合金片具有更适合成骨细胞黏附的表面粗糙度，骨组织表面的粗糙度大约是32 nm，当种植体表面的粗糙度与骨组织表面相似，即达到纳米级后，可以极大的提升成骨细胞在其表面的黏附能力，因为适宜的表面粗糙度有利于更多黏附相关蛋白的吸收，如纤维连接蛋白等[19-20]。

MC3T3-E1 Subclone 14细胞体外培养3、6 h的荧光染色结果显示：与无表面处理的钛合金片表面相比，含氟纳米二氧化钛薄膜结构的SLM打印钛合金片表面成骨细胞黏附数量较多，细胞形态铺展较好，肌动蛋白更加伸展，呈指状突起，肌动蛋白纤维更加清晰。细胞体外培养3 d后的扫描电镜观察结果进一步证实：与无表面处理的钛合金片表面相比，含氟纳米二氧化钛薄膜结构的SLM打印钛合金片表面成骨细胞黏附形态铺展较好，呈长梭形，伪足细长，触角较多。细胞形态是细胞受不同材料表面影响的最直观的表现形式，细胞骨架对细胞黏附、增殖、分化等生物学行为非常重要，清晰的细胞骨架网络可能会使细胞黏附增强[21-22]。研究表明，成骨细胞在纳米结构的钛表面会伸出丰富的丝状伪足，锚定在纳米结构上，有利于细胞的黏附和增殖[23-24]。细胞黏附形态观察的实验结果与CCK-8法测得的细胞黏附实验结果相一致，即含氟纳米二氧化钛薄膜结构可以促进MC3T3-E1 Subclone 14细胞的伸展，从而促进其在材料表面的黏附。

细胞增殖实验结果显示：从体外培养第3天开始，细胞在含氟纳米二氧化钛薄膜结构的钛合金片表面的增殖能力显著高于无表面处理的钛合金片表面，而在第1天两组钛合金片表面成骨细胞的增殖能力无明显差异。有研究结果表明，亲水性以及粗糙的表面更适合成骨细胞的增殖[8,25]。培养1 d时两组钛合金片之间无明显差异可能是由于细胞密度较低、作用时间较短，使得两组钛合金片表面成骨细胞的增殖无明显差异。

种植体周围炎形成的生物学原理是多种细菌附着在种植体表面形成细菌生物膜，导致种植体周围感染并产生炎症。同细胞的黏附一样，细菌的黏附也是一个复杂的过程，它取决于许多因素，如细菌种类与特征、材料表面的化学成分、表面电荷、润湿性和粗糙度等。众多研究表明，纳米二氧化钛表面改性以及表面加载氟离子均可提高材料表面的抗菌性能。Lorenzetti等[26]用水热处理法在钛表面合成具有纳米结构的二氧化钛涂层，这种涂层可影响蛋白质吸附和促进骨再生，与无涂层的钛表面相比，表面黏附的大肠杆菌减少了50%。Bhadra等[27]运用水热法在钛表面制备了模仿蜻蜓膜翅的纳米线阵列结构，这种表面具有高表面自由能和亲水性，与细菌接触时会引起细菌胞膜的变形、破裂。该表面对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为50%和20%。与无涂层材料相比，二氧化钛涂层显著促进了成骨细胞的黏附和增殖，并显示出针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抗菌效能。Arenas等[28]通过阳极氧化等方法在钛表面制备了含氟二氧化钛屏障，并通过与无氟的二氧化钛样品进行对照，结果表明氟的存在降低了细菌在其表面的黏附，氟是增强表面抗菌性能的关键。Yan等[29]在钛上构建了多功能含氟锆金属有机框架薄膜结构（Zr-MOF），并证实由于氟离子的释放，该结构对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出良好的抗菌性能，且Zr-MOF的抗菌活性随着氟化物含量的增加而提高。表面加载的氟离子释放后可以抑制表面细菌的生长，在一定范围内，氟的掺入量越高，抗菌能力越强[11]。

本实验选用种植体周围炎中最常见也最具代表性的革兰阴性菌（大肠杆菌）和革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌），用平板活菌计数和活/死菌染色实验来检测SLM打印钛合金片的抗菌性能。平板活菌计数结果显示，与无表面处理的钛合金片共培养4 h后的细菌在琼脂固体培养基平板上生长旺盛，而与含氟纳米二氧化钛薄膜结构的钛合金片共培养后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长可被明显抑制，材料表面表现出较强的抗菌能力。经过菌落计数发现，与含氟纳米二氧化钛薄膜结构的钛合金片共培养后大肠杆菌抑菌率达61.20%，金黄色葡萄球菌抑菌率达69.05%。活死菌染色实验结果显示，无表面处理的钛合金片表面有较多的绿色荧光和较少的红色荧光，而在培养相同时间的含氟二氧化钛纳米薄膜的钛合金片表面有较多的红色荧光和较少的绿色荧光，且金黄色葡萄球菌组的差异较大肠杆菌组明显，这与平板活菌计数实验结果一致，含氟二氧化钛纳米薄膜结构具有一定的抗菌杀菌的作用。这与其表面二氧化钛纳米结构和加载的氟离子有密切关系。

尽管已有体内外结果显示，与不含氟的钛片表面相比，含氟的钛片表面具有更高的成骨活性和抗菌性能[12,28-29]。但是本实验没有提供有关的数据表明氟离子的释放可以在纳米二氧化钛薄膜提高钛合金片生物活性和抗菌活性的基础上进一步提高其生物活性和抗菌活性。后续会增加对照实验，进一步明确该实验中氟的作用，评价氟的释放量与钛合金片处理表面生物活性及抗菌活性的关系。

利用SLM 3D打印个性化种植体是目前种植体发展的重要方向，由于种植体表面结构对其骨结合性能有重要影响，因此利用表面处理技术在打印的钛合金种植体表面构建一层含氟的纳米二氧化钛薄膜结构，有利于改善表面的亲水性和表面的粗糙度，进而促进成骨细胞的黏附、增殖、分化。对照实验表明，与无表面处理的钛合金表面相比，含氟纳米二氧化钛薄膜结构可以促进成骨细胞在SLM打印钛合金表面的黏附和增殖，较SLM 3D打印钛合金片常规表面结构具有更好的生物相容性。同时，含氟纳米二氧化钛薄膜结构可以抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，较SLM打印钛合金片常规表面结构具有更好的抗菌性能。