错配修复蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 在结直肠癌中的表达及临床意义

樊秀双（天津市东丽医院病理科，天津 300300）

结直肠癌早期缺乏典型性表现，确诊时多数患者病情已进入晚期阶段，5 年生存率不足10%，是我国癌症死亡的第二大原因［1-2］。结直肠癌主要存在微卫星不稳定性（MSI）、染色体不稳定性、表观遗传不稳定性，其中MSI 与DNA 错配修复蛋白基因缺陷密切相关，可能参与肿瘤发生、进展［3-4］。目前已知错配修复蛋白有9 种，其中PMS2、MLH1、MSH6、MSH2为目前临床研究热点。本研究选取2018年1月至2022 年1 月我院收治的的330 例结直肠癌患者的病理标本，分析4 项错配修复蛋白在结直肠癌中的表达及临床意义，旨在为临床后续诊治提供科学依据。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年1 月至2022 年1 月我院收治的330 例结直肠癌患者的病理标本，其中男204 例、女126 例；年龄29~78（52.64±2.16）岁；肿瘤位置：右半结肠93例、左半结肠111例、直肠126例：肿瘤大小：≥5 cm 78 例，<5 cm 252 例；淋巴结转移：有144例、无186例；分化程度：高中分化110例、低分化220例。本研究经我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：（1）符合结直肠癌相关诊断标准［5］，经手术病理或结肠镜活检证实；（2）患者签署知情同意书；（3）认知功能正常；（4）临床资料完整。排除标准：（1）林奇综合征；（2）合并其他恶性肿瘤；（3）精神疾患。

1.3 方法

1.3.1 试剂与仪器 福建迈新生物技术有限公司的免疫组化SP 法检测试剂盒、DAB 显色剂；鼠单抗MLH1、兔单抗MSH6、鼠单抗 MSH2、兔单抗PMS2均购自福州迈新公司；上海博迅电热鼓风干燥箱；RM2235切片机德国LEICA；珠海黑马医学仪器有限公司的Thermo 离心机；北京中杉金桥生物公司提供的PBS缓冲液；日本Olympus公司的显微镜。

1.3.2 标本处理 所有标本用10%中性福尔马林固定，脱水、石蜡包埋后，将其切片，厚度为4 µm，用65℃烤片2 h，用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各脱蜡10 min，分别用95%乙醇、100%乙醇、75%乙醇、85%乙醇的酒精实施5 min 的脱二甲苯，分别使用自来水、蒸馏水冲洗，将酒精脱去。完成后PBS缓冲液冲洗切片3次，每次30 min。在高压锅内加入1 000 ml EDTA 抗原修复液（pH 为8.0），加热至沸腾。脱蜡至水后，切片架上摆放切，置于高压锅内，确保液面没过石蜡切片，将锅盖盖好，避免烫伤。待高压锅喷汽后计时2.5 min，冷水内放置高压锅，降至室温后取出切片。PBS 缓冲液连续冲洗3 次修复后的切片，5 min/次。用3%过氧化氢封闭10 min，将内源性过氧化酶消除，PBS 缓冲液连续冲洗3 次，5 min/次。取出切片，保持组织湿润基础上，尽量将组织周边的缓冲液擦干，湿盒内滴加一抗至完全覆盖组织，放置在4℃冰箱内过夜。取出切片，室温下放置至恢复室温，用PBS 缓冲液连续冲洗3 次，5 min/次。组织周边的缓冲液擦拭后，将二抗（EDTA）滴加于组织表面至完全覆盖组织。PBS缓冲液连续冲洗3次，5 min/次，切片取出，将DAB显色剂滴加于其表面，放置5 min，随后置于水内终止显色，用自来水冲漂洗3 min。苏木素复染1 min 的，冲洗（流水），放置在盐酸酒精分化液中5 min，清水中冲洗。用95%乙醇I、95%乙醇II、100%乙醇I各脱水1 min，取出切片，风干，在镜下进行结果判读。

1.4 判断标准 MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 均定位于细胞核，细胞核不着色为缺失，阳性细胞呈棕黄色或黄色颗粒。每张切片在高倍显微镜（400 倍）下随机选择10个视野，计数阳性细胞的百分数。阴性：阳性细胞率为0，1 分：<10%：2 分：11%~50%；3 分：51%~80%，4分：>80%。染色强度：不着色为0分，浅黄色为1分，深黄色为2分，深棕色为3分。阳性细胞率与染色强度分数相乘评分≥2 分表示为阳性表达。MLH1、PMS2、MSH2、MSH6任意一项缺失评定为MSI。

1.5 临床观察指标 分析4种错配修复蛋白在结直肠癌中的表达情况在结直肠癌中的表达情况及其与临床病理特征（性别、淋巴结转移、分化程度、肿瘤大小、年龄等）的关系。

1.6 统计学处理 数据采用SPSS 21.0统计学软件进行处理。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，行t检验；计数资料采用例（百分率）表示，行χ2检验。P<0.05示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4种错配修复蛋白在结直肠癌中的表达情况分析 330 份结直肠癌标本中、MSH6 缺失率30 例（9.09%）、MLH1 缺失15 例（4.55%）、PMS2 缺失9 例（2.73%）MSH2缺失9例（2.73%），MSI率为20.00%（66/330）。4种错配修复蛋白在结直肠癌中表达。见图1~8。

图1 结直肠癌组织中MLH1阳性表达（IHC×400）

图2 结直肠癌组织中MLH1阴性表达（IHC×400）

图3 结直肠癌组织中PMS2阳性表达（IHC×400）

图4 结直肠癌组织中PMS2阴性表达（IHC×400）

图5 结直肠癌组织中MSH2阳性表达（IHC×400）

图6 结直肠癌组织中MSH2阴性表达（IHC×400）

图7 结直肠癌组织中MSH6阳性表达（IHC×400）

图8 结直肠癌组织中MSH6阴性表达（IHC×400）

2.2 4种错配修复蛋白表达与结直肠癌的临床病理特征的关系分析 MLH1 缺失率与结直肠癌患者发病位置、淋巴结转移和分化程度有关（P<0.05），PMS2、MSH6缺失率与结直肠癌患者发病位置、分化程度有关（P<0.05），MSH2缺失率与结直肠癌患者淋巴结转移有关（P<0.05）。见表1。

表1 4种错配修复蛋白表达与结直肠癌的临床病理特征的关系分析[n(%)]

3 讨论

正常情况下人体内存在一条完整的由错配修复系统基因编码的DNA 错配修复系统能够避免细胞复制出现异常，对DNA 复制过程中发生错配碱基进行识别，并实施水解，修复DNA 复制过程中发生的异常情况，具有维持遗传的完整性、稳定性以及增强物质的真实性等特点，可起到遗传物质保真之效［6-8］。另外，错配修复蛋白可纠正DNA复制过程中长的不匹配核苷酸和微卫星中移码突变，其表达异常可引起原癌基因、肿瘤抑制基因或DNA 修复基因突变，促使正常结肠上皮细胞转化为肿瘤细胞，促进肿瘤发生［9-10］。当错配修复蛋白发生甲基化或缺失、突变时，可造成简单重复序列丢失或增多，促使细胞癌变或突变［11-12］。故，早期对错配修复蛋白筛查，评估患者病情，有助于预防癌变。

本研究中，330 份结直肠癌标本中MLH1 缺失15例（4.55%）、PMS2缺失9例（2.73%）、MSH2缺失9例（2.73%）、MSH6 缺失率30 例（9.09%），MSI 率为20.00%（66/330）；MLH1 缺失率与结直肠癌患者发病位置、淋巴结转移和分化程度有关（P<0.05），PMS2、MSH6缺失率与结直肠癌患者发病位置、分化程度有关，MSH2 缺失率与结直肠癌患者淋巴结转移有关，提示结直肠癌中有较高的错配修复蛋白缺失率，其与肿瘤发生、进展有关，可作为临床诊治结直肠癌的重要指标。MLH1、PMS2、MSH6 缺失均与发病位置有关，且多见于右半结肠，可能与生理功能、胚胎起源和血管供应等各种生物学和临床差异有关。右侧结直肠早期不易出现症状，随着肿瘤快速增长至引起全身症状和腹部肿块，此时总量大小更大且分析相对较晚，而左半结肠癌早期易出现消化道局部症状，患者易发现而及时就诊，分析较早。MSI 属于DNA 序列，由不等核苷酸串联重复形成，具有高度遗传稳定性，产生MSI 原因是重复拷贝数发生较大变化，促使重要基因如PMS2、MLH1 等发生功能改变，致使MS 发生滑脱，使基因组的不稳定性明显增加，细胞自发突变频率明显提高，促使细胞增生和分发异常，降低遗传稳定性和导致肿瘤发生［13-14］。MLH1、MSH2 蛋白是二聚体中的主导蛋白，可能与同源性错配修复蛋白形成二聚体发挥作用，两者突变可降解二聚体蛋白，造成主导蛋白与配对蛋白表达缺失。MLH1 启动子高甲基环或MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 基因突变均可引起错配修复蛋白失活，发挥错配修复作用，可造成微卫星DNA 极度不稳定性，甚至发生出转录、复制错误和正常细胞增殖、分化异常，为肿瘤发生、进展提供基础［15］。

综上所述，结直肠癌患者易出现MLH1、PMS2、MSH2、MSH6蛋白缺失和MSI率，各蛋白缺失与肿瘤位置、淋巴结转移、分化程度有一定关系，可作为临床判断患者病情的重要指标。