不同预处理对酒精浸制标本DNA提取效果比较

刘鹏冀，王文强，2，苑彩霞，2*

（1. 延安大学生命科学院；2. 陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西延安 716000）

随着分子生物学研究的不断发展，越来越多的昆虫分类研究者将分子生物技术应用于昆虫多样性、系统发育、近缘种识别、基因遗传、进化关系等领域［1-2］。研究昆虫DNA 信息的基础便是昆虫DNA的提取［3］。常规的DNA 提取方法一般使用新鲜的昆虫样品作为材料，但研究所需要的昆虫样本大多来自于野外采集，采集到的标本在携带和运输的过程中长时间放置易变质，DNA 易降解。因此进行分子研究的昆虫标本在野外多采用无水乙醇进行保存，这种保存方法经济、简便且无毒，能在一定程度上减缓DNA 的降解速度，但是长时间的酒精浸泡也会引起细胞中的蛋白质与DNA 间产生严重的交联，导致提取到的DNA 质量变差，难以扩增目标序列，不能达到预期的实验目标，有时可通过增加样品数量或进行多次DNA 提取来选出合格的DNA 样品［4］。而对于数量较少的珍贵酒精浸制标本则无法用增加样品数量的方法来提高DNA 产量，从而影响整体实验的效果和进度。通过预处理来提高DNA的产量和质量就成了酒精浸制昆虫标本的关键步骤。

高质量的DNA 对于解决物种或基因之间的关系、物种的起源和传播等生物学问题至关重要，若是通过预处理方式提高长期保存的酒精浸制标本DNA 提取的浓度和质量，则能够大大提高可用于分子研究的标本范围，这有助于进行更加准确的系统发育判断，同时也有助于进行更加广泛的分子问题研究。近年来，一些研究者在干制昆虫标本DNA 提取前进行预处理以达到提高DNA 质量和产量的目的［5-11］。目前干制昆虫标本最常用的样品预处理物质有0.9%NaCl溶液、Tris-EDTA 盐水缓冲液（STE）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）和无菌水，0.9%NaCl 溶液、STE 盐水缓冲液、PBS 磷酸缓冲盐溶液对干制昆虫标本的基因组DNA 的得率均有一定程度的提高，无菌水处理则会降低DNA的得率［1，4，12］。HUANG等［2］通过对瓢虫干制标本预处理的研究发现0.9%NaCl溶液和STE 缓冲液的预处理效果优于PBS 缓冲液。对于昆虫酒精浸制标本而言，目前尚不清楚这4 种预处理方式是否具有同样的提升效果。

朽木甲亚科Alleculinae 昆虫隶属鞘翅目Coleoptera，拟步甲科Tenebrionidae，是重要的传粉昆虫，但也侵害植物，属于进出口竹材的检疫对象［13］。本研究以酒精浸泡的朽木甲标本作为研究对象，使用0.9%NaCl 溶液、STE 缓冲液、PBS 缓冲液和无菌水4 种物质分别对其进行预处理，借鉴其他学者［3，14-23］对昆虫标本DNA 提取的研究经验，提取其DNA 并对线粒体COI 基因片段及28S-D2 核基因片段进行PCR 扩增，并对4 种预处理方式提取的DNA 浓度及凝胶电泳条带质量进行比较分析，筛选出对朽木甲酒精浸制标本DNA 提取优化效果最佳的处理方式。

1 材料与方法

1.1 实验标本

试验所用昆虫标本为阿尔泰栉甲指名亚种Cteniopinus（s. str.）altaicus altaicus（Gebler，1829）酒精浸制标本采集于陕西省子午岭国家级自然保护区，均用75%乙醇保存，带回实验室后用无水乙醇-20 ℃保存，标本信息见表1。

表1 标本信息

1.2 研究方法

1.2.1 预处理方式

将昆虫标本去掉鞘翅和腹部，用无菌水反复冲洗掉昆虫体表酒精，放在烘箱中50 ℃烘10 min，以去除标本体内的酒精，随后将标本放入离心管，每管内放1个标本。将虫体分为5组，每组进行3次重复，分别进行以下处理：①灭菌0.9%NaCl 溶液浸泡24 h；②灭菌STE 缓冲液浸泡24 h；③灭菌PBS 溶液浸泡24 h；④无菌水浸泡24 h；⑤CK 对照处理，继续用无水乙醇浸泡，浸泡处理期间室温保持在20 ℃，每个样本加1 mL浸泡液。

1.2.2 DNA提取

参照昆虫DNA 提取试剂盒（Omega Bio-tek，USA）提取并进行以下优化：

1）预处理的标本从浸泡液中取出后用无菌水冲洗掉表面浸泡液，烘干体表浸泡液后放入1.5 mL无酶离心管中，避免残留预处理液对提取步骤产生影响；

2）直接在1.5 mL 微量无酶离心管中加入液氮，使用一次性微管杵粉碎样品至粉末状，减少在研钵中研磨再倒入离心管中造成的样品损失，从而降低操作误差对实验结果的影响；

3）延长空柱子离心时间至10 min，避免乙醇残留对下游实验的影响；

4）洗脱前将Elution Buffer 预热至60 ℃，再加入柱子中，并在孵育5 min 后进行2 次洗脱，避免部分样品产物浓度偏低。

使用微量紫外分光光度计测定每个样品DNA浓度及OD 值，用来体现DNA 质量。将提取后DNA保存于-20 ℃冰箱中用于PCR扩增。

1.2.3 PCR扩增

采用AG 2×Pro Master Mix（湖南艾科瑞生物工程有限公司）进行PCR扩增。PCR反应体系20 μL：模板DNA 1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，无菌水7.4 μL。PCR 反应温度体系：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性30 s；48 ℃退火30 s，循环35 次；70 ℃延伸50 s；72 ℃最终延伸50 s。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统拍照。引物由上海生工生物技术公司合成，引物序列见表2。

表2 引物序列信息[24-25]

1.2.4 数据处理

数据使用SPSS 20.0 统计软件正态性和方差齐性检验，采用平均值±标准差（Mean SD）表示，进行单因素方差分析，P<0.05 与P<0.01 分别表示差异显著与极显著。采用GraphPad Prism 8绘制DNA 浓度和凝胶电泳灰度值图。采用Image J 对凝胶电泳条带灰度值进行测量。

2 实验结果

2.1 不同预处理DNA浓度及纯度分析

为了研究不同预处理方式对DNA 提取质量的影响，通过微量紫外分光光度计对不同预处理组DNA提取样本的OD值和DNA浓度进行检测（图1）。不同预处理方式的OD260/280值在1.729~1.849 之间，纯度均在合理范围内，且没有显著差异。从图1 中可以看出，不同预处理方式对DNA 浓度所造成的影响差异较大，4 种预处理方式中除了无菌水，0.9%NaCl 溶液、STE 缓冲液、PBS 缓冲液其他3 种预处理方式均对DNA 浓度有显著提升（P<0.05），其中PBS预处理的DNA 提取浓度最高，相较于对照组和无菌水处理提高极显著（P<0.01）。

2.2 基因片段的PCR扩增

提取到足够浓度的DNA 后，还需要基因片段足够完整以保证PCR 扩增能够顺利进行，因此进一步分别对线粒体COI 基因片段和核基因28S-D2 基因片段的PCR 扩增结果进行凝胶电泳拍照和灰度值的分析（图2和图3）。

图1 不同预处理方式DNA浓度显著性分析图

由图2 可知，相较于无菌水处理，经过其他3 种预处理方式的凝胶电泳条带更加清晰明亮，其中N2和P3 这2 个条带最为明亮。对照组条带清晰，但是不如0.9%NaCl 溶液、STE 缓冲液、PBS 缓冲液预处理组明亮，说明0.9%NaCl 溶液、STE 缓冲液和PBS缓冲液这3 种预处理方式有助于保护DNA 链的完整性，有利于PCR 的扩增，而无菌水处理则不利于PCR 扩增。由图3 可见，对于线粒体COI 基因片段，预处理方式对于凝胶电泳条带灰度值没有显著的提升（P>0.05）。

图2 2种引物PCR凝胶电泳图

由图3 可以得出，对于核基因28S-D2 基因片段，0.9%NaCl 溶液、STE 缓冲液、PBS 缓冲液这3 种预处理的灰度值相较于无菌水处理均提升极显著（P<0.01），相较于对照组提升显著（P<0.05）。图2中PBS 缓冲液和0.9%NaCl 溶液预处理条带更加明亮，P3 条带最为明亮，说明PBS 预处理对核基因PCR 扩增优化效果更好。H3 几乎没有扩增出条带，其他无菌水的条带亮度也很微弱，说明无菌水对核基因PCR 扩增的负面影响更大，相较于对照组更易使DNA 片段断裂。

图3 2种引物PCR凝胶电泳灰度值显著性分析图

3 讨论

通过DNA 提取浓度和凝胶电泳结果表明：0.9%NaCl 溶液、STE 缓冲液和PBS 缓冲液3 种预处理方式能够有效提高提取的DNA 浓度，并有助于基因片段的扩增，其中使用PBS 缓冲液进行预处理对于酒精浸制朽木甲标本DNA 的综合提取优化效果最好。HUANG 等［2］在瓢虫干制标本的预处理对比中发现0.9% NaCl 溶液、STE 缓冲液的预处理效果优于PBS 缓冲液。标本的预处理需要缓冲液调节渗透压和pH 值，通过缓慢地渗透作用使细胞在尽可能不被破坏的情况下恢复到正常的生理环境，这有利于提高后续DNA 提取的质量。PBS 缓冲液和STE 缓冲液均能起到这样的作用，根据之前有关DNA 提取的研究和本实验的结果推测：对于昆虫来说，在干制标本中使用STE 缓冲液进行预处理有助于脱水的肌肉组织缓慢的恢复到正常的生理状态，从而优化DNA提取的效果［1-2，4，6，14］。在酒精浸制标本中使用PBS 缓冲液进行预处理有助于解决长时间的酒精浸泡引起细胞中的蛋白质与DNA 间产生严重交联的问题，从而优化DNA 提取效果。这样在对不同保存方式的昆虫DNA 进行提取预处理时可以选择更加合适的试剂，有助于对昆虫基因的进一步研究。

本研究得到不同预处理方式对昆虫样品提取到的DNA的OD260/280值差距不大，结合李枷霖等［1］对干制昆虫标本的预处理方式研究结果，推测其原因可能是：1）DNA 的OD260/280值的大小主要与样本的种类有关，不同的处理方式对其影响较小；2）本实验所采用的昆虫标本保存条件稳定，保存时间不是很长，DNA 的质量相对较高，从OD 值看不出不同预处理方式造成的差异。

从图3 可以看出0.9%NaCl 溶液、STE 缓冲液、PBS 缓冲液3 种预处理方式对于核基因的扩增提升效果极显著。而对于线粒体基因条带的扩增提升效果并不显著。由此推测0.9% NaCl 溶液、STE 缓冲液、PBS 缓冲液这3 种预处理方式对于昆虫酒精浸制标本核基因DNA 片段的扩增优化效果更佳，其中经过PBS预处理扩增出的条带更加明亮。

张德华等［4］认为使用无菌水进行预处理在换水过程中会使部分细胞内DNA 丢失，因此为避免细胞DNA 流失，实验在用无菌水预处理的过程中并未进行换水操作。但是相较于对照组在样品DNA 的浓度及凝胶电泳的图像上并没有看出对于样品DNA提取的优化效果。从图2 可以看出，用无菌水进行预处理后对核基因片段的扩增效果甚至不如对照组，起到了负面的效果，因此无菌水在预处理的过程中不但易使细胞吸水破裂降低提取到的DNA 浓度，还会使DNA 片段断裂，影响基因PCR 的扩增效果。在昆虫DNA 提取的过程中应尽量减少昆虫样本与无菌水的接触。

0.9%NaCl溶液、STE缓冲液、PBS缓冲液和无菌水4 种预处理方式对朽木甲酒精浸制标本DNA 质量浓度及凝胶电泳图像的结果表明，使用无菌水不会提高DNA 提取的产量，且会降低PCR 扩增的效果，对DNA 的提取效果起到负面的作用；使用0.9%NaCl溶液、STE缓冲液、PBS缓冲液对朽木甲酒精浸制标本进行预处理可以提高DNA 提取浓度，对DNA 基因片段扩增效果也有提升，特别是在核基因片段中优化效果更好。综合来看使用PBS 缓冲液对朽木甲酒精浸制标本进行预处理对DNA 的提取效果最佳，这有助于优化昆虫DNA 提取的方法和思路。为在提取昆虫DNA 的过程中，面对不同保存方式、不同基因片段进行预处理提供了更多的参考，减少了在DNA 提取过程中标本数量的消耗，一定程度上扩展了可研究标本的范围，为后续的分子研究工作奠定基础。